[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的夾心ELISA定量檢測法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010253460.0
• 申請日: 2020-04-02
• 公開（公告）號: CN111443200B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王乃東;鄒亞文;楊毅;于浩洋;王東亮;湛洋;楊文兵
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南陽銘永康生物科技有限公司;湖南陽銘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 鄭明

1.一種非診斷目的的豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒夾心定量ELISA檢測法，其特征在于該方法是基于硫酸乙酰肝素（heparan?sulfate，HS）包被板，純化的豬圓環(huán)病毒多克隆抗體，羊抗兔的酶標(biāo)抗體，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了豬圓環(huán)病毒2型（porcine?type?2，PCV2）病毒樣顆粒定量的夾心ELISA方法；

所述反應(yīng)條件的優(yōu)化是利用PCV2?VLPs作為標(biāo)準(zhǔn)品建立了用于定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測最低濃度62.5?ng/mL，相關(guān)系數(shù)R²為0.998。

2.如權(quán)利要求1所述一種非診斷目的的豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒夾心定量ELISA檢測法，其特征在于該方法包括以下步驟：

（1）用pH?7.4的PBS將HS稀釋至1?μg/mL，按每孔100?μL加入96孔板中包被12?h，棄去板中液體，用300?μL?PBST洗滌5次，拍干剩余液體；

（2）加入100?μL?BSA封閉液封閉3?h，棄去板中液體，用300?μL?PBST洗滌5次，拍干剩余液體；

（3）PCV2?VLPs進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋后，分別加入孔中，于37?℃反應(yīng)60?min，棄去板中液體，用300?μL?PBST洗滌5次，拍干剩余液體；

（4）將豬圓環(huán)病毒多克隆抗體按1:2000進(jìn)行稀釋后，分別加入孔中于37?℃反應(yīng)60min，棄去板中液體，用300?μL?PBST洗滌5次，拍干剩余液體；

（5）羊抗兔的酶標(biāo)二抗按1:?7000稀釋后于37?℃反應(yīng)30?min，棄去板中液體，用300?μLPBST洗滌5次，拍干剩余液體；

（6）加入50?μL?TMB室溫顯色5?min；

（7）加入50?μL?2?M的H₂SO₄終止反應(yīng)，OD₄₅₀讀數(shù)；P/N=（陽性實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值）/（陰性對照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明結(jié)果為最優(yōu)，陰性孔OD₄₅₀＜0.2且P/N2時(shí)成立。

3.如權(quán)利要求1所述一種非診斷目的的豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒夾心定量ELISA檢測法，其特征在于該方法用于PCV2?VLPs的夾心ELISA快速定量及組裝效率評價(jià)。