[發明專利]合成海藻糖的重組解脂耶氏酵母菌的構建方法

在審

• 申請號: 202010252783.8
• 申請日: 2020-04-01
• 公開（公告）號: CN111500617A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 程海榮;鄒亞文
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12P19/04;C12R1/645
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

本發明公開了一種合成海藻糖的重組解脂耶氏酵母菌的構建方法。以能合成赤蘚糖醇的解脂耶氏酵母菌為合成底盤，將海藻糖合成酶基因構成表面展示基因表達盒并轉化能合成赤蘚糖醇的解脂耶氏酵母，構成重組解脂耶氏酵母菌。然后以該重組酵母菌先發酵葡萄糖生成赤蘚糖醇，分離酵母細胞用作全細胞催化劑一步轉化麥芽糖生成海藻糖。轉化結束后在轉化液中加入氮源和無機鹽，接種釀酒酵母分解轉化液中的雜質得到高純度海藻糖。由于該方法采用酵母全細胞轉化，相對于破細胞純化酶等工藝，不但減少了步驟，而且無酶制備成本。

技術領域

本發明屬于食品生物技術領域，涉及一種合成海藻糖的重組解脂耶氏酵母菌的構建方法；具體是利用解脂耶氏酵母表面展示海藻糖合成酶一步轉化麥芽糖合成海藻糖的方法。

背景技術

海藻糖(Trehalose)由兩分子α-葡萄糖通過α-1，1糖苷鍵連接，屬于非還原性二糖(non-reducing disaccharide)，最早在十九世紀早期從黑麥麥角中發現的，后來在各種動植物，微生物細胞中均發現海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脫水的細胞中含量豐富。比如，在干燥的復活草(如鱗片卷柏Selaginella lepidophylla)、休眠的線蟲(nematodes)、脫水面包酵母(baker’s yeast)、干燥的地衣植物中含量豐富(Elbein etal.New insights on trehalose:a multifunctional molecule.Glycobiology,13:17-27)，這些生物細胞中失去99％的水分仍能生存若干年，而當有水存在時能迅速恢復細胞活力。在脫水面包酵母中，海藻糖的含量占據細胞干重的10～15％左右。

海藻糖在細胞中的存在，除了作為能源儲存外，更多的作為抵御外界不良環境的保護劑(protectant)，使得細胞中的大分子(如酶)在極端條件下(如高溫、低pH、干燥、冷凍等)仍然具有活性，能維持細胞質中大分子的結構以及維持細胞膜的完整性(Ohtani andUsui.1994.Production of trehalose by fermentation and its application.FoodChem,2:91-95；Singer and Nas-Lindquist.1998.Multiple effects of trehalose onprotein folding in vitro and in vivo.Mol Cell,1:639-648)。由于沒有還原基團，海藻糖與富含氨基酸的食品配料混合后在高溫下不會發生美拉德反應，能良好的保持食品的風味。海藻糖還具有良好的持水性，能與失水細胞中殘余的水牢固結合保護生物大分子的結構完整性(Belton and Gil.1994.IR and Raman spectroscopics studies of theinteraction of trehalose with hen egg white lysozyme.Biopolymers,34:957-961)。

由于海藻糖具有上述優良的生理生化特性，其在醫藥領域、食品領域以及化妝品領域都得到十分廣泛的應用。

在醫藥領域常用于疫苗、血液制品、抗體的穩定劑，使疫苗在常溫下以及冷凍的條件下同樣具有穩定性，增加血液制品以及抗體在冷凍條件下的穩定性(Patent WO1996/022107)。海藻糖還可以和透明質酸配伍用于制備眼部用藥傳遞系統以及潤滑劑(中國發明專利200410036422.0，200410075549.3)，還可以制成關節腔內注射藥劑，起到抗氧化和抗自由基的作用，改善炎癥癥狀，為軟骨修復提供所需要的糖分，加速軟骨的修復(中國發明專利200610103472.5)。同時海藻糖還可以進行衍生化合成其它的藥物，在防止腫瘤的侵襲以及轉移具有顯著的效果(中國發明專利201010246792.2，201110150999.4)。海藻糖的衍生物還可以用于制備皮膚外用劑，具有促進血液循環，保濕，吸收紫外線以及抗氧化的功效(Patent WO2004/071472,JP2004/001401)。