[發(fā)明專利]一種基于ATP探針富集激酶技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010252095.1 | 申請日： | 2020-04-01 |
| 公開（公告）號： | CN111351878A | 公開（公告）日： | 2020-06-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張益 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海中科新生命生物科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N30/02 | 分類號： | G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/34;G01N30/72 |
| 代理公司： | 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350 | 代理人： | 肖平安 |
| 地址： | 201109 上海*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 atp 探針 富集 激酶 技術(shù) 蛋白質(zhì) 研究 方法 | ||
一種基于ATP探針富集激酶技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究方法，首先將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行裂解，并從裂解后的樣品中各取一份樣品分別進(jìn)行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集階段中添加ATP探針富集蛋白激酶，最后再分別對富集后的蛋白和肽段進(jìn)行高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜分析，具有蛋白激酶檢測率高、靈敏度高，同時為激酶定性定量研究提供新的實驗方法。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于ATP探針富集激酶技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究方法。
背景技術(shù)
蛋白激酶可以催化蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞很多生理功能，比如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等，其異常表達(dá)與很多疾病比如腫瘤、糖尿病和老年癡呆等密切相關(guān)。目前蛋白激酶數(shù)量大約有518種，是非常重要的藥物靶點(diǎn)，也是目前藥物研究的熱點(diǎn)。國內(nèi)外科研院所及醫(yī)藥企事業(yè)單位的激酶組研究市場需求比較大，因此，激酶富集和質(zhì)譜定性定量技術(shù)具有重要意義。
但是目前的蛋白激酶檢測分析方法中，常常由于蛋白激酶的含量不足造成檢測靈敏度低、速度慢和經(jīng)常漏檢的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于ATP探針富集激酶技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究方法，首先將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行裂解，并從裂解后的樣品中各取一份樣品分別進(jìn)行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集階段中添加ATP探針富集蛋白激酶，最后再分別對富集后的蛋白和肽段進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，具有蛋白激酶檢測率高、靈敏度高，同時為激酶定性定量研究提供新的實驗方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種基于ATP探針富集激酶技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究方法，首先將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行裂解，并從裂解后的樣品中各取一份樣品分別進(jìn)行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集階段中添加ATP探針富集蛋白激酶，最后再分別對富集后的蛋白和肽段進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。
根據(jù)以上方案，所述的基于ATP探針富集激酶技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究方法，包括如下步驟：
步驟S1樣品預(yù)處理，取待檢測細(xì)胞樣品，提取細(xì)胞樣品中的蛋白，作為蛋白樣品，向提取出的蛋白樣品中添加裂解液(Lysis buffer)，混勻使蛋白變性，將變性蛋白樣品溶劑置換為反應(yīng)緩沖液(Reaction Buffer)，換溶劑后的蛋白樣品溶液中加入蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物(Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail(100X)(1:100稀釋))，樣品在冰面上放置，從置換溶劑后的蛋白樣品溶液中取出兩份樣品分別進(jìn)行步驟S2和步驟S3。
步驟S2，取步驟S1中獲得的其中一份蛋白樣品溶液，加入1M的MgCl2溶液，混勻，將1mM的ATP探針(desthiobitin-ATP)溶液加入到蛋白樣品溶液中，室溫放置8-12min，再加入濃度均為8M的尿素/IP混合裂解液(Urea/IP Lysis buffer)，再加入50％的高容量鏈霉親和素瓊脂糖樹脂(High Capacity Stretavidin Agarose Resin)，旋轉(zhuǎn)混勻，孵育30-90min，離心取出樹脂，并重復(fù)多次使用濃度均為4M的尿素/IP混合裂解液處理樹脂，再取出樹脂使用SDT緩沖液提取樹脂中的蛋白樣品，提取出的蛋白樣品再進(jìn)行FASP酶解，酶解后的樣品進(jìn)行脫鹽處理去除酶解液，采用0.1％甲酸溶液復(fù)溶脫鹽處理的樣品，備用；
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