[發明專利]一種基于ATP探針富集激酶技術的蛋白質組研究方法

在審

• 申請號: 202010252095.1
• 申請日: 2020-04-01
• 公開（公告）號: CN111351878A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 張益
• 申請（專利權）人: 上海中科新生命生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 肖平安

1.一種基于ATP探針富集激酶技術的蛋白質組研究方法，其特征在于，首先將蛋白質樣品進行裂解，并從裂解后的樣品中各取一份樣品分別進行蛋白水平富集和肽段水平富集，在富集階段中添加ATP探針富集蛋白激酶，最后再分別對富集后的蛋白和肽段進行高效液相色譜-串聯質譜分析。

2.根據權利要求1所述的基于ATP探針富集激酶技術的蛋白質組研究方法，包括如下步驟：

步驟S1樣品預處理，取待檢測細胞樣品，提取細胞樣品中的蛋白，作為蛋白樣品，向提取出的蛋白樣品中添加裂解液，混勻使蛋白變性，將變性蛋白樣品溶劑置換為反應緩沖液，換溶劑后的蛋白樣品溶液中加入蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物，樣品在冰面上放置，從置換溶劑后的蛋白樣品溶液中取出兩份樣品分別進行步驟S2和步驟S3。

步驟S2，取步驟S1中獲得的其中一份蛋白樣品溶液，加入1M的MgCl₂溶液，混勻，將1mM的ATP探針溶液加入到蛋白樣品溶液中，室溫放置8-12min，再加入濃度均為8M的尿素/IP混合裂解液，再加入50％的高容量鏈霉親和素瓊脂糖樹脂，旋轉混勻，孵育30-90min，離心取出樹脂，并重復多次使用濃度均為4M的尿素/IP混合裂解液處理樹脂，再取出樹脂使用SDT緩沖液提取樹脂中的蛋白樣品，提取出的蛋白樣品再進行FASP酶解，酶解后的樣品進行脫鹽處理去除酶解液，采用0.1％甲酸溶液復溶脫鹽處理的樣品，備用；

步驟S3，取步驟S1中獲得的其中一份蛋白樣品溶液，加入1M的MgCl₂溶液，混勻，將1mM的ATP探針溶液加入到蛋白樣品溶液中，室溫放置8-12min，再加入濃度均為8M的尿素/IP混合裂解液，再加入500mM二硫蘇糖醇，37℃孵育20-40min，加入1M的碘乙酰胺，黑暗反應30min，再將樣品溶劑替換為含有20mM的三(羥甲基)氨基甲烷的2M尿素溶液，再向樣品中加入胰蛋白酶酶解12-24h，再加入50％的高容量鏈霉親和素瓊脂糖樹脂，旋轉混勻，孵育30-90min，離心取出樹脂，并重復多次使用IP裂解液處理樹脂，再采用PBS溶液清洗樹脂，再使用含有0.1％的三氟乙酸的50％乙腈溶液對樹脂進行洗脫，將洗脫液冷凍干燥，用0.1％甲酸溶液復溶脫鹽處理的樣品，備用；

步驟S4，將步驟S2和步驟S3獲得的樣品分別進行高效液相色譜-串聯質譜分析。

3.根據權利要求2所述的基于ATP探針富集激酶技術的蛋白質組研究方法，其特征在于，所述的步驟S1中的裂解液添加量為體積比1：2＝蛋白樣品溶液：裂解液；所述的蛋白樣品液置換溶劑具體為通過7KDa的Zeba脫鹽離心柱進行溶劑置換。

4.根據權利要求2所述的基于ATP探針富集激酶技術的蛋白質組研究方法，其特征在于，所述的步驟S1中提取出蛋白樣品后和蛋白樣品液置換溶劑后使用BCA定量法對蛋白進行定量，同時將置換溶劑后的蛋白樣品溶液稀釋到2mg/ml，再取出步驟S2和步驟S3的樣品。

5.根據權利要求2所述的基于ATP探針富集激酶技術的蛋白質組研究方法，其特征在于，所述的步驟S2和S3中的MgCl₂的用量為10μl，所述的ATP探針的用量為10μl；所述的步驟S2和S3中的尿素/IP混合裂解液的用量為500μl；所述的步驟S2和S3中的高容量鏈霉親和素瓊脂糖樹脂的用量為50μl；所述的步驟S2和步驟S3中孵育后提取樹脂的離心條件為1000g離心1min；所述的步驟S2中使用濃度均為4M的尿素/IP混合裂解液處理樹脂為向樣品中加入500μl尿素/IP混合裂解液，混勻，1000g離心1min；所述的步驟S2中的使用SDT緩沖液提取樹脂中的蛋白樣品為加入50μl的SDT緩沖液，沸水浴5min，1000g離心1min；所述的步驟S2中酶解后的樣品采用MCX萃取柱進行脫鹽。