[發明專利]一種單個外泌體的分離方法和核酸測序方法

在審

• 申請號: 202010251176.X
• 申請日: 2020-04-01
• 公開（公告）號: CN111394296A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 胡朝陽
• 申請（專利權）人: 豐能醫藥科技（上海）有限責任公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京勁創知識產權代理事務所(普通合伙) 11589
• 代理人: 張鐵蘭

本發明提供了一種單個外泌體的分離方法和核酸測序方法，屬于生物檢測技術領域，所述分離方法包括以下步驟：1)從體液中分離獲得批量外泌體；2)將所述批量外泌體與油質液滴溶液混合獲得混懸液；3)將所述混懸液用微流控通道進行分離獲得單個液滴包裹的單個外泌體；所述油質液滴溶液中單個油質液滴的粒徑為150～250nm。本發明所述方法操作簡單，能夠實現單個外泌體的分離以及核酸測序。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，尤其涉及一種單個外泌體的分離方法和核酸測序方法。

背景技術

外泌體(exosomes)是一種細胞向胞外空間分泌的直徑大約為30～150nm的具有脂質雙層膜的微小膜泡，不同來源外泌體大小也有一定的差異。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，包括血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水、腦脊液等；外泌體還可通過體液循環等途徑到達其他細胞或組織。外泌體攜帶和傳遞重要的信號分子，通過在細胞間傳遞各種信號分子，參與細胞間通訊，從而調控多種生理過程。研究表明外泌體可能與多種疾病的發生和進程有關系。外泌體中富含核酸(microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、膽固醇等物質，這些物質通過外泌體實現在體內的轉運。

目前分離外泌體的方法有超速離心法和超過濾法。分離獲得的外泌體純度不高，并且獲得的是批量的外泌體，并不能獲得單個外泌體。而不同來源的外泌體之間存在一定的異質性，常規的外泌體分離方法不能實現單細胞水平的外泌體分析。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種單個外泌體的分離方法和核酸測序方法，所述方法操作簡單，能夠實現單個外泌體的分離以及核酸測序。

本發明提供了一種單個外泌體的分離方法，包括以下步驟：1)從體液中分離獲得批量外泌體；2)將所述批量外泌體與油質液滴溶液混合獲得混懸液；3)將所述混懸液用微流控通道進行分離獲得單個液滴包裹的單個外泌體；所述油質液滴溶液中單個油質液滴的粒徑為150～250nm。

優選的，步驟2)中所述的批量外泌體與油質液滴溶液的體積比為1:(8～12)。

優選的，步驟2)中所述的批量外泌體與油質液滴溶液的體積比為1:10。

優選的，步驟2)中所述混合的溫度為20～25℃。

優選的，步驟2)中所述混合的時間為4～8min。

優選的，步驟3)中所述的微流控通道為300nm級通道。

優選的，所述體液包括血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水、腦脊液、鼻腔分泌物和陰道分泌物中的一種。

優選的，步驟1)中所述分離獲得批量外泌體的方法包括超速離心法、超濾法、體積排阻色譜、微流控、親和法和基于聚合物的共沉淀法中的一種。

本發明提供了一種單個外泌體的核酸測序方法，包括以下步驟：對所述的分離方法分離獲得的單個外泌體進行建庫測序或納米孔測序。

本發明的有益效果：本發明提供了一種單個外泌體的分離方法，所述方法利用特定粒徑的單個油質液滴包裹單個外泌體，然后再利用微流控技術分離單個油質液滴，實現單個外泌體的分離，操作簡單，分離效果提升30％以上。

具體實施方式

本發明提供了一種單個外泌體的分離方法，包括以下步驟：1)從體液中分離獲得批量外泌體；2)將所述批量外泌體與油質液滴溶液混合獲得混懸液；3)將所述混懸液用微流控通道進行分離獲得單個液滴包裹的單個外泌體；所述油質液滴溶液中單個油質液滴的粒徑為150～250nm。