[發明專利]一種超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中16種真菌毒素的方法

在審

• 申請號: 202010250908.3
• 申請日: 2020-04-01
• 公開（公告）號: CN111366652A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 劉文靜;傅建煒;黃彪;韋航
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 福州旭辰知識產權代理事務所(普通合伙) 35233
• 代理人: 楊清雅

本發明提供了一種超高效液相色譜?串聯質譜法測定茶葉中16種真菌毒素的方法，屬于分析化學技術領域。樣品經甲酸/乙腈（10:90）提取，加入QuEChERS鹽包振搖離心，提取液過OASIS PRIME HLB小柱和Dspe凈化管處理，以Waters HSS T₃色譜柱分離，采用正負離子同時掃描的多反應離子監測（MRM）模式，茶葉基質匹配標準溶液，同位素內標法定量。本方法穩定、準確、靈敏、快速，能夠滿足各種茶葉中多種毒素殘留分析的需求。

技術領域

本發明涉及分析化學技術領域，尤其涉及一種超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中16種真菌毒素的方法。

背景技術

真菌毒素(mycotoxins)是某些真菌在一定環境條件下產生的，危害人和動物的次級毒性代謝產物。迄今發現超過400種真菌毒素，主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、單端孢霉烯族毒素中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉素、桔青霉素等。這些毒素經口或皮膚吸入對人和動物具有急性毒性，還可作用于肝臟、腎臟、神經系統、內分泌系統和免疫系統，具有致畸、致癌、致突變、中毒性腎損害、肝細胞毒性、免疫抑制和生殖紊亂等慢性毒性。中國是茶葉的生產、出口和消費大國，關于茶葉尤其普洱茶、茯磚茶等發酵茶中真菌毒素污染已引起消費者的關注。雖然茶葉加工過程干燥環節可能殺滅茶中的大多數微生物，但若包裝、貯藏不當，尤其茶葉吸濕受潮之后，可能受到真菌和真菌毒素污染。已有報道檢出茶葉污染黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、赭曲霉毒素、T-2毒素等真菌毒素。陳年老茶亦稱年份茶，是指存儲一段時間后具有保健功能的茶葉，由于其需要存儲過程較長，存儲不當將有可能導致茶葉發霉變質，產生毒素。目前國內外對一些茶葉中有關的黃曲霉菌B₁、赭曲霉菌A等單一真菌毒素污染情況的檢測分析較多，但是缺乏對茶葉中10種或10以上真菌毒素同時檢測的研究。因此有必要建立一種同時檢測茶葉中多種真菌毒素的方法。

目前，茶葉中真菌毒素的檢測方法主要包括薄層色譜法、酶聯免疫法、氣相色譜-串聯質譜聯用法、液相色譜-串聯質譜聯用法等。其中，酶聯免疫法容易出現假陽性，只能作為篩查方法；高效液相色譜法需要柱前或柱后衍生，柱前衍生形成的副產物可能對色譜分離造成較大困難，在衍生化過程中，容易引入雜質或干擾峰，或使樣品損失，柱后衍生對于一定的溶劑和有限的反應時間來說，所供選擇的反應條件有限，容易造成反應不充分，或者反應副產物過多，而且柱后衍生需要額外的設備，反應器可造成峰展寬，降低分辨率，最終不但會影響定量結果，而且會對儀器帶來污染；液相色譜-串聯質譜聯用技術與其它方法相比，定量更加準確，選擇性和靈敏度也更高，已逐漸取代傳統的液相色譜方法應用于茶葉中真菌毒素的檢測。目前采用液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測茶葉毒素的前處理步驟比較復雜，需要使用到多功能進化柱、免疫親和柱進行對提取液進行凈化。國標中涉及的樣品類型基質比較簡單，通過兩次凈化基本能去除雜質。但對于基質復雜的茶葉而言，簡單的兩次凈化，是很難去除雜質，而雜質過多將導致質譜分析時基質效應明顯，最終定量不準確。因此必須采用更高效的方法對樣品提取液進行凈化。

不同真菌毒素對溶劑要求不一，例如黃曲霉毒素不溶于水，一些含羧基基團毒素如伏馬毒素、赭曲霉毒素等含有羧基集團毒素需要偏酸環境下進行提取。同時，有些提取溶劑更容易將茶葉中一些酸、醇、酚類等雜質提取到提取液中，而有些溶劑提取則提取液中雜質較少，因此選擇最佳的提取溶劑對后續凈化、檢測以及樣品回收率等均有很大的影響。

采用液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測毒素過程中，流動相的選擇影響到檢測物的峰型、檢測所需的時間等，因此，建立一種較好的流動相和梯度洗脫程序，可提高檢測的靈敏度和減少檢測時間，從而提高檢測效率。

目前國內外對茶葉中多種真菌毒素的檢測方法不穩定，靈敏度低，只能同時檢測一種或幾種毒素，檢測效率低，未見同時檢測10種以上真菌毒素，且不能同時檢測不同品種茶即不同程度發酵茶中的多種真菌毒素。本發明即針對上述的高效提取溶劑、凈化環節和高效的流動相洗脫梯度程序等3個問題而研究提出。

發明內容