[發明專利]合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株及其構建方法和用途

在審

• 申請號: 202010244552.2
• 申請日: 2020-03-31
• 公開（公告）號: CN113462708A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 宋浩;房立霞;曹英秀
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/31;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株及其構建方法和用途，構建方法為：將tesA’基因和dcas9基因連接到質粒YX212，構建重組質粒pCF，將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌株CF；將ihfA?Low片段與Sg?S片段連接，構建重組質粒Sg?LihfA，將其轉化菌株CF，得到重組菌株LihfA；將P_BAD?T1片段和aidB基因依次連接到質粒Sg?LihfA，構建重組質粒Sg?LihfA?OaidB，將其轉化菌株CF，得到重組菌株LihfA?OaidB。本發明構建的重組大腸桿菌菌株LihfA和LihfA?OaidB通過調控與脂肪酸代謝非直接相關基因的表達高效合成游離脂肪酸。

技術領域

本發明涉及生物合成和生物能源技術領域，更具體的說是涉及合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株及其構建方法和用途。

背景技術

游離脂肪酸被廣泛應用于多個領域，可用作洗滌劑、潤滑劑、化妝品添加劑和藥物制劑；作為重要的前體物，其衍生的烷/烯烴和脂肪酸酯比短鏈醇具有更高的能量密度，并且與汽油不存在10％～20％的混合壁壘，被認為是更有潛力的替代燃料；而其衍生的脂肪醇和三酰甘油等產品因具有優良的親疏水性，也是洗滌劑、潤滑劑、化妝品和藥物等多種化學工業產品的主要原料。

現階段游離脂肪酸主要從石油或動植物中提取，存在可持續性差、與糧食爭地等問題，因此利用工程微生物高效地合成可再生脂肪酸成為了近年來的研究熱點。因為遺傳背景清晰，大腸桿菌的脂肪酸代謝和調控被最早研究。

野生型大腸桿菌基本不生成游離脂肪酸，表達去掉前導肽的內源硫酯酶基因(tesA’)，可以將細胞內積累的酯酰-ACP轉化為游離脂肪酸。大腸桿菌脂肪酸代謝過程如圖1所示。通過過表達合成路徑中的關鍵基因、敲除旁路代謝途徑基因、上下游代謝模塊的適配等代謝工程改造，工程大腸桿菌合成脂肪酸的產量取得了很大的進步，展示了大腸桿菌巨大的工業脂肪酸合成潛力。

目前工程大腸桿菌合成游離脂肪酸的研究多集中于對脂肪酸代謝路徑相關基因的改造，尚未有通過調控細胞內源與脂肪酸代謝非直接相關的基因的表達來提高大腸桿菌脂肪酸合成的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株。

本發明的第二個目的是提供一種合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株的構建方法。

本發明的第三個目的是提供一種合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株合成游離脂肪酸的用途。

本發明的第四個目的是提供第二種合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株。

本發明的第五個目的是提供第二種合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株的構建方法。

本發明的第六個目的是提供第二種合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株合成游離脂肪酸的用途。

本發明的技術方案概述如下：

合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株的構建方法，包括如下步驟：

(1)將tesA’基因和dcas9基因連接到質粒YX212，構建重組質粒pCF；所述tesA’基因為大腸桿菌BL21(DE3)內源的截掉前導肽序列的硫酯酶基因的縮寫；所述dcas9基因是釀膿鏈霉菌(Streptococcuspyogenes)來源的Cas9蛋白編碼基因按大腸桿菌BL21(DE3)密碼子優化并突變兩個堿基的縮寫；

所述tesA’基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述dcas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YX212質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)將質粒pCF轉化到菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株CF；