[發明專利]合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株及其構建方法和用途

在審

• 申請號: 202010244552.2
• 申請日: 2020-03-31
• 公開（公告）號: CN113462708A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 宋浩;房立霞;曹英秀
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/31;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：

(1)將tesA’基因和dcas9基因連接到質粒YX212，構建重組質粒pCF；所述tesA’基因為大腸桿菌BL21(DE3)內源的截掉前導肽序列的硫酯酶基因的縮寫；所述dcas9基因是釀膿鏈霉菌(Streptococcuspyogenes)來源的Cas9蛋白編碼基因按大腸桿菌BL21(DE3)密碼子優化并突變兩個堿基的縮寫；

所述tesA’基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述dcas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YX212質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)將質粒pCF轉化到菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株CF；

(3)將靶向大腸桿菌BL21(DE3)內源基因ihfA的sgRNA表達盒ihfA-Low片段與Sg-S骨架片段酶切連接，構建重組質粒Sg-LihfA；

所述ihfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述ihfA-Low片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述Sg-S骨架片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(4)將重組質粒Sg-LihfA轉化到重組菌株CF中，得到合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株LihfA。

2.權利要求1的構建方法構建的合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株LihfA。

3.權利要求2的合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株LihfA合成游離脂肪酸的用途。

4.合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株的構建方法，其特征是包括如下步驟：

(1)將tesA’基因和dcas9基因連接到質粒YX212，構建重組質粒pCF；所述tesA’基因為大腸桿菌BL21(DE3)內源的截掉前導肽序列的硫酯酶基因的縮寫；所述dcas9基因是釀膿鏈霉菌(Streptococcuspyogenes)來源的Cas9蛋白編碼基因按大腸桿菌BL21(DE3)密碼子優化并突變兩個堿基的縮寫；

所述tesA’基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述dcas9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YX212質粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)將質粒pCF轉化到菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株CF；

(3)將靶向大腸桿菌BL21(DE3)內源基因ihfA的sgRNA表達盒ihfA-Low片段與Sg-S骨架片段酶切連接，構建重組質粒Sg-LihfA；

所述ihfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述ihfA-Low片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述Sg-S骨架片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(4)將P_BAD-T1片段和大腸桿菌BL21(DE3)內源的損傷修復蛋白基因aidB依次連接到重組質粒Sg-LihfA，構建重組質粒Sg-LihfA-OaidB；

所述aidB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述P_BAD-T1片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

(5)將重組質粒Sg-LihfA-OaidB轉化到重組菌株CF中，得到合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株LihfA-OaidB。

5.權利要求4的構建方法構建的合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株LihfA-OaidB。

6.權利要求5的合成游離脂肪酸重組大腸桿菌菌株LihfA-OaidB合成游離脂肪酸的用途。