[發明專利]一種BSA單抗制備方法

在審

• 申請號: 202010234313.9
• 申請日: 2020-03-30
• 公開（公告）號: CN112694531A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 韓之波
• 申請（專利權）人: 天津昂賽細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

本發明提供一種BSA單抗制備方法，所述制備方法為：制備多肽：首先制備10mg純度為90％的多肽，并取其中5mg多肽與KLH偶聯；動物免疫：選取五只小白鼠，首先進行初次免疫，接著進行第二次免疫，并重復第二次免疫步驟對小白鼠進行第三次免疫，接著進行第四次免疫；細胞融合；篩選：選擇陽性值高且單克隆的孔；培養擴增所選擇的單克隆雜交瘤細胞并凍存細胞；得到純化的單克隆抗體。本發明能夠制備出大量的單克隆抗體，將制備的抗體分裝后在?20℃溫度下保存，短期內使用在2?8℃存放，使用時，僅需按所需濃度將此溶液進行稀釋，現配現用，大大提高了抗體的生產量，并通過檢驗發現單克隆抗體抗體能夠與BSA結合，不能夠與HAS結合，為未來醫學發展奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于單抗制備方法領域，尤其涉及一種BSA單抗制備方法。

背景技術

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術來制備，雜交瘤抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

單抗制備的過程主要是：1.免疫動物：免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的過程，一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射，抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

2.細胞融合：采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平器皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

3.選擇性培養：選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡，未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。

4.雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化：在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養，采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增，經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

5.單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內誘生法和體外培養法。

(1)體內誘生法：取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體，約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

(2)體外培養法：將雜交瘤細胞置于培養瓶中進行培養，在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限，各種新型培養技術和裝置不斷出現，大大提高了抗體的生產量。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供一種BSA單抗制備方法，所述BSA單抗制備方法為：

S1：制備多肽：首先制備10mg純度為90％的多肽，其中多肽的肽序為KEACFAVEGPKLVVSTQT，取其中5mg多肽與KLH偶聯；