[發明專利]一種BSA單抗制備方法

在審

• 申請號: 202010234313.9
• 申請日: 2020-03-30
• 公開（公告）號: CN112694531A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 韓之波
• 申請（專利權）人: 天津昂賽細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

1.一種BSA單抗制備方法，其特征在于，所述BSA單抗制備方法為：

S1：制備多肽：首先制備10mg純度為90％的多肽，其中多肽的肽序為KEACFAVEGPKLVVSTQT，取其中5mg多肽與KLH偶聯；

S2：動物免疫：選取五只小白鼠，首先進行初次免疫，將KLH偶聯多肽與等體積福氏完全佐劑混合，等到乳化后對小白鼠進行皮下免疫，為每只小白鼠皮下注射400ul乳化液；接著進行第二次免疫，將1mg/ml的KLH抗原與等體積福氏不完全佐劑進行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，并重復第二次免疫步驟對小白鼠進行第三次免疫，進行第三次免疫的10天后，分別在每只小白鼠的眼靜脈取血，并進行離心處理，取血清進行ELISA檢測，并將第三次免疫后小白鼠的血清保存；接著進行第四次免疫，將1mg/ml的KLH抗原與等體積福氏不完全佐劑進行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，第四次免疫的10天后，分別在每只小白鼠的眼靜脈取血，并進行離心處理，取血清進行ELISA檢測，并將第四次免疫后小白鼠的血清保存；

S3：細胞融合：復蘇和培養小白鼠骨髓瘤細胞，取四次免疫后終免的小白鼠脾臟并用培養基制備成單個細胞懸液，按1：5的比例混合小白鼠的骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞，加入PEG進行細胞融合，制成融合細胞液，將100ul/孔的2×HAT完全培養基鋪入96孔板中，在每個孔內加入100ul融合細胞液，在融合細胞培養過程中用1×HAT進行半量換液；

S4：篩選：用Balb/c健康小鼠制備飼養細胞，有限稀釋選好的融合孔細胞，用1×HAT培養液稀釋細胞，將細胞懸液分別加入含飼養細胞的96孔中，濃度分別為100ul/孔，孔中分別含有0.75、1.5和3個飼養細胞，并加入含有質量分數為5％的CO₂，在37℃的溫度下對飼養細胞進行培養；10天后在顯微鏡下觀察飼養細胞克隆生長情況，用ELISA檢測細胞克隆孔，選擇陽性值高且單克隆的孔，且篩選出來的抗體能夠與BSA結合，不能夠與HAS結合；

S5：細胞擴增：培養擴增所選擇的單克隆雜交瘤細胞并凍存細胞；

S6：抗體生產純化：將小白鼠用石蠟致敏后，向小白鼠的腹腔內注射雜交瘤細胞；觀察7-10天后小鼠腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可采集腹水；進行預處理后的腹水使用Protein G柱子進行孵育，洗脫，最終得到純化的單克隆抗體；

S7：單克隆雜交瘤細胞樣本檢驗：首先利用Trizol法提取雜交瘤細胞總RNA，再使用SMART Race技術將樣品RNA反轉錄成cDNA；利用FastPfu Fly DNAPolymerase試劑盒擴增并獲得重鏈和輕鏈可變區；使用T4連接酶將目標片段連接至pUC57載體，并將連接產物轉化進大腸桿菌感受態細胞，后挑取單克隆進行測序，最后使用IMGT/V-QUEST數據庫進行測序結果比對做進一步分析，并得到檢驗結果。

2.根據權利要求1所述的一種BSA單抗制備方法，其特征在于，所述ELISA檢測步驟為：

(1)抗原包被量為100ng/孔，其中抗原為HAS、BSA標準品，每孔濃度為100ul，利用PBS進行稀釋，在4℃溫度下保存17-19h；

(2)倒掉上清液，每孔加入200ul的無蛋白封閉劑，在37℃溫度下，震蕩2h；

(3)倒掉上清液，拍干液體，在-20℃溫度下凍存備用；

(4)凍存后取出包被好的板子放至室溫，每孔加入100ul的血清稀釋液，在37℃溫度下放置1h。

(5)用0.1％的PBST洗板3次；

(6)用辣根酶標記山羊抗小鼠，并用濃度為1ul、體積10ml的PBS稀釋，在37℃溫度下放置45min；

(7)用PBST洗板3次；

(8)在每個孔中加入100ul的TMB，在37℃溫度下放置15min；

(9)加入2M鹽酸終止液終止反應，并利用450nm波長測OD值。

3.根據權利要求1所述的一種BSA單抗制備方法，其特征在于，所述ELISA檢測細胞克隆孔過程中，若檢測不確定是單克隆，則需要進行第二次有限稀釋。