[發(fā)明專利]提高微生物轉(zhuǎn)化生成乳糖酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010233506.2
• 申請日: 2020-03-30
• 公開（公告）號: CN111172206B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發(fā)明（設計）人: 劉加林;霍蕭勇;劉加海;方朝杰;張淵源
• 申請（專利權）人: 杭州巴洛特生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/58
• 分類號: C12P7/58;C12N1/20;C12R1/39
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于生物技術領域，公開了提高微生物轉(zhuǎn)化生成乳糖酸的方法，其包括如下步驟：步驟1）一次發(fā)酵：將熒光假單胞菌種子液接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)20?24h，然后添加促進培養(yǎng)基；繼續(xù)發(fā)酵24?36h，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液；步驟2）二次發(fā)酵：將一次發(fā)酵的發(fā)酵液進行陶瓷膜過濾，收集濾液和濕菌體，將濕菌體打回發(fā)酵罐，然后添加二次發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)10?14h，停止發(fā)酵，將二次發(fā)酵液進行過濾，收集濾液；合并兩次濾液用于后續(xù)分離提取乳糖酸。本發(fā)明對廢棄的濕菌體進行了二次利用，變廢為寶，提高了乳糖酸的產(chǎn)率。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及提高微生物轉(zhuǎn)化生成乳糖酸的方法。

背景技術

乳糖酸是一種重要的藥物中間體，廣泛已應用于醫(yī)藥制備技術領域。目前，合成乳糖酸的方法主要包括化學法、酶法以及生物法。市場應用的乳糖酸主要由化學法制得，高耗能且需要昂貴的金屬催化劑。化學法所用到的化學試劑是一些有毒的且昂貴的試劑；在反應過程中還會有副產(chǎn)物產(chǎn)生；利用金屬催化合成乳糖酸，金屬催化劑容易鈍化；化學法對pH和溫度的穩(wěn)定的要求相對嚴格，還容易產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，造成環(huán)境污染。酶法合成乳糖酸相對于化學法具產(chǎn)物相對單一、產(chǎn)物易于分離和條件溫和等優(yōu)點，但是用于生物催化的酶需要生產(chǎn)和進一步純化，而這些步驟成本較高，費時費力。

乳糖酸的生物合成法是一種可行的方法，這種方法可以克服化學法和酶法合成乳糖酸的缺陷，綠色環(huán)保，而且能耗低，可持續(xù)發(fā)展性強。中國專利技術“CN101988046A”公開了一種利用熒光假單胞菌生產(chǎn)乳糖酸的方法，該方法以乳糖為轉(zhuǎn)化底物，添加氮源和無機鹽作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在最優(yōu)選的條件下，轉(zhuǎn)化率可達到90%，但是該發(fā)酵過程時間較長，持續(xù)時間為120h，此外還需要添加其他碳源，增加了成本，提高了后續(xù)分離純化的難度。中國專利技術“CN102703542A”和“CN102250986A”分別通過超聲波和高壓物理場技術對熒光假單胞菌進行刺激，對乳糖酸的轉(zhuǎn)化率有一定的提升作用。文獻“乳糖酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，食品工業(yè)科技2014年”?以乳糖酸生產(chǎn)菌土生拉烏爾菌為實驗菌株，在單因素實驗的基礎上進行優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，使得發(fā)酵液中乳糖酸的濃度和轉(zhuǎn)化率大幅提高。

目前，生物轉(zhuǎn)化合成乳糖酸的研究大多處于實驗室階段，為了使得微生物催化乳糖生產(chǎn)乳糖酸應用于工業(yè)生產(chǎn)中，以滿足其日益增長的市場的需求，針對某一特定的產(chǎn)乳糖酸的微生物，我們需要解決以下幾個問題：首先，需要盡可能高地提高底物乳糖的濃度，從而提高乳糖酸的產(chǎn)量；其次，通過提高乳糖酸的轉(zhuǎn)化率來提高生產(chǎn)效率；最后，控制培養(yǎng)時間和成本，并且減輕后續(xù)分離純化產(chǎn)品的難度。據(jù)此，申請人之前的專利技術“一種利用生物法合成乳糖酸的工藝”對熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，通過添加促進培養(yǎng)基，提高了乳糖酸的生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在上述專利技術的基礎上，繼續(xù)對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以進一步提高乳糖酸的產(chǎn)量。

本發(fā)明是通過如下技術方案來實現(xiàn)的。

提高微生物轉(zhuǎn)化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟1）一次發(fā)酵：將熒光假單胞菌活化，然后接種到種子培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)得到熒光假單胞菌種子液，將熒光假單胞菌種子液按照5-10％的接種量接種于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)20-24h，然后添加促進培養(yǎng)基；繼續(xù)發(fā)酵24-36h，停止發(fā)酵，得到發(fā)酵液；整個發(fā)酵過程中，通過流加氨水控制pH為6.0-6.2；

步驟2）二次發(fā)酵：將一次發(fā)酵的發(fā)酵液進行陶瓷膜過濾，收集濾液和濕菌體，將濕菌體打回發(fā)酵罐，然后添加二次發(fā)酵培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)10-14h，停止發(fā)酵，將二次發(fā)酵液進行過濾，收集濾液；合并兩次濾液用于后續(xù)分離提取乳糖酸。

優(yōu)選地，所述促進培養(yǎng)基的制備方法為：將木質(zhì)素和氯化鈉按照1:?50-100的質(zhì)量比混勻制得。