[發(fā)明專利]一種生物標(biāo)記組合應(yīng)用的評(píng)價(jià)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010227665.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN111118227A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳仁人;張楊;陸俊卿;陳均權(quán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 劉巧霞;裘暉

本發(fā)明公開了一種生物標(biāo)記組合應(yīng)用的評(píng)價(jià)方法，包括步驟：采集樣品和提取DNA；選取特異性引物；制作qPCR反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線；選取目標(biāo)源強(qiáng)特征和非目標(biāo)物種干擾強(qiáng)度作為參數(shù)評(píng)價(jià)引物特性；計(jì)算特異性標(biāo)記物在目標(biāo)樣本庫(kù)中檢出濃度的上四分位點(diǎn)與各非目標(biāo)物種中假陽性信號(hào)的下四分位點(diǎn)的差值，根據(jù)差值實(shí)現(xiàn)非目標(biāo)物種干擾強(qiáng)度的分類；以數(shù)字代表非目標(biāo)物種對(duì)標(biāo)記物的干擾強(qiáng)度，從n個(gè)不同的標(biāo)記物中任取m個(gè)引物并組成一組，來模擬能檢測(cè)到n種標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)室條件，計(jì)算不同組合相應(yīng)的評(píng)分，根據(jù)該評(píng)分得到該組合的評(píng)價(jià)結(jié)果。本發(fā)明可解決使用單個(gè)標(biāo)記物存在的靈敏度較低或特異性較差等缺陷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)研究領(lǐng)域，特別涉及一種生物標(biāo)記組合應(yīng)用的評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)

動(dòng)物糞便中含有大量從體內(nèi)排出的病原微生物和腸道病毒，未經(jīng)處理排放至環(huán)境水體中會(huì)導(dǎo)致介水性疾病的爆發(fā)，給人類健康帶來極大風(fēng)險(xiǎn)。例如，2003年發(fā)生的SARs病毒傳染和2020年爆發(fā)的新型冠狀病毒疫情均有可能通過“糞-口”傳播的方式感染人類，引起呼吸道方面的疾病。此外，糞便在環(huán)境中自身分解所產(chǎn)生的醇類、酚類、氨、苯和硫化氫等也會(huì)造成水環(huán)境的污染。因此，如何準(zhǔn)確識(shí)別水環(huán)境中存在的糞便污染并制定有效的污染防治措施，是改善水質(zhì)質(zhì)量、保護(hù)人民用水健康的關(guān)鍵問題。

糞大腸菌群和大腸埃希氏菌等傳統(tǒng)指示菌作為最早開發(fā)出的反應(yīng)水體糞便污染狀況的微生物指標(biāo)，已被世界各國(guó)沿用多年。中國(guó)的地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB3838-2002）中也包含了與糞大腸菌群檢出濃度相對(duì)應(yīng)的水質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。然而，此類傳統(tǒng)指示菌廣泛存在于各類動(dòng)物糞便中，僅能用于評(píng)價(jià)水體中的糞便污染程度，無法識(shí)別污染來源，也不能對(duì)各污染源進(jìn)行定量化解析，從而導(dǎo)致水體微生物污染防治工作停留在“見污治污”的被動(dòng)模式中，極大增加了管理和治理的成本。此外，不同動(dòng)物糞便中含有的致病菌種類也各不相同，對(duì)人體的致病菌機(jī)理差異顯著，若無法準(zhǔn)確識(shí)別微生物污染來源，也難以有效評(píng)估糞便污染對(duì)人類帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)水平。

近年來，歐、美等發(fā)達(dá)國(guó)家已針對(duì)解析糞便污染源的問題率先開發(fā)出以宿主特異性生物標(biāo)記為基礎(chǔ)的微生物污染溯源（Microbial source tracking, MST）技術(shù)，其主要思想是針對(duì)不同物種腸道微生物中所包含的特異性序列設(shè)計(jì)出具有“指紋功能”的特異性序列。通過檢測(cè)該特異性序列在水環(huán)境中的陽性/陰性結(jié)果可以直接識(shí)別出水體中的糞便污染來源。同時(shí)，對(duì)特異性序列進(jìn)行定量分析還可以量化各污染源的相對(duì)貢獻(xiàn)率，為水體糞便污染的針對(duì)性治理提供有效的信息。

然而，目前已開發(fā)出的各類標(biāo)記物中尚不存在具有絕對(duì)特異性的標(biāo)記物。同時(shí)，已有較多研究發(fā)現(xiàn)，在特異性標(biāo)記物設(shè)計(jì)階段，靈敏度（指衡量引物測(cè)出特定基因片段的能力，靈敏度是能夠與特定基因片段進(jìn)行配對(duì)的引物正確地判定為真陽性的比例）和特異性二項(xiàng)指標(biāo)往往無法兼顧，其中一項(xiàng)指標(biāo)的提升通常會(huì)導(dǎo)致另一項(xiàng)指標(biāo)的下降。因此，單一使用某一種標(biāo)記物無法準(zhǔn)確獲得水體中糞便的污染源信息。而同時(shí)使用特性不同的標(biāo)記物進(jìn)行組合可以有效的克服上述源解析工作中存在的缺陷。但目前尚未有根據(jù)引物特性有效組合不同引物進(jìn)行微生物污染源解析的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種生物標(biāo)記組合應(yīng)用的評(píng)價(jià)方法，該方法建立度量不同非目標(biāo)物種對(duì)標(biāo)記物特異性干擾強(qiáng)度的分類方法，結(jié)合標(biāo)記物的源強(qiáng)特征和非目標(biāo)物種干擾強(qiáng)度等定量指標(biāo)，建立不同標(biāo)記物的最優(yōu)組合方法，可解決使用單個(gè)標(biāo)記物存在的靈敏度較低或特異性較差等缺陷。

本發(fā)明的目的通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種生物標(biāo)記組合應(yīng)用的評(píng)價(jià)方法，包括步驟：

S1：采集樣品，并提取DNA；

S2：選取特異性引物；

S3：制作qPCR反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S4：為識(shí)別引物在不同動(dòng)物糞便中的濃度分布特征，選取目標(biāo)源強(qiáng)特征和非目標(biāo)物種干擾強(qiáng)度作為參數(shù)評(píng)價(jià)引物特性；