[發明專利]一種生物標記組合應用的評價方法

在審

• 申請號: 202010227665.1
• 申請日: 2020-03-27
• 公開（公告）號: CN111118227A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 吳仁人;張楊;陸俊卿;陳均權
• 申請（專利權）人: 生態環境部華南環境科學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 劉巧霞;裘暉

1.一種生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，包括步驟：

S1：采集樣品，并提取DNA；

S2：選取特異性引物；

S3：制作qPCR反應和標準曲線；

S4：為識別引物在不同動物糞便中的濃度分布特征，選取目標源強特征和非目標物種干擾強度作為參數評價引物特性；

S5：計算特異性標記物在目標樣本庫中檢出濃度的上四分位點與各非目標物種中假陽性信號的下四分位點的差值，根據所述差值實現非目標物種干擾強度的分類；

S6：建立標記物組合方法，步驟是以數字代表非目標物種對標記物的干擾強度，標記物組合是指從n個不同的標記物中任取m個引物并組成一組，來模擬能檢測到n種標記物的實驗室條件，計算不同組合相應的評分，根據該評分得到該組合的評價結果。

2.根據權利要求1所述的生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，步驟S1中，DNA提取的方法是：采用糞便基因組提取試劑盒，每份糞便混勻后稱取一定量放入滅菌離心管中，進而按照試劑盒說明書進行DNA提取。

3.根據權利要求1所述的生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，步驟S3中，在選取特異性引物后，以不同人和動物的糞便樣本DNA為模板，對選取的各類宿主特異性引物進行擴增；為構建標準品，對各特異性引物采用對應的樣本DNA進行PCR擴增，擴增后的目標產物通過DNA純化試劑盒進行純化回收；

回收后的噬菌體引物擴增產物連接到pGEM?-T載體上，其它回收產物連接到pMD 19-TVector載體上，連接完成后，均轉化至DH5α感受態細胞，采用氨芐抗生素含量為1:1000的平板培養基篩取陽性克隆，并提取質粒DNA，同時測定相應的DNA濃度，計算目的片段拷貝數；制備的質粒均進行10倍梯度稀釋，稀釋為10^-0, 10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6 7個梯度；以各梯度質粒為模板，每個梯度設置3個重復，進行qPCR擴增，通過反應獲得的Cq值構建相應的標準曲線，各標準曲線的相關系數均大于0.97，且擴增效率在90-110%之間，表明各標準曲線合格。

4.根據權利要求3所述的生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，qPCR擴增包括熒光染料和熒光探針兩種方法。

5.根據權利要求1所述的生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，步驟S4中，目標源強特征和非目標物種干擾強度屬于定量分析指標，是基于各標記物在目標宿主中的真陽性信號強度和在不同非目標物種中獲得的假陽性信號強度計算得到。

6.根據權利要求1所述的生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，步驟S5中，根據所述差值實現非目標物種干擾強度的分類，具體分類方法是：

當差值＞0時，非目標物種中的假陽性信號遠小于標記物的目標源強，則該非目標物種為弱干擾非目標物種；

當差值＜0時，非目標物種中產生的假陽性信號對標記物產生中度干擾，則該非目標物種為中度干擾非目標物種；

若非目標物種與標記物不產生假陽性反應，則該非目標物種定義為絕對特異性非目標物種；

若非目標物種中產生的假陽性信號與標記物真陽性信號強度在同一數量級，則定義該非目標物種為顯著干擾物種。

7.根據權利要求1所述的生物標記組合應用的評價方法，其特征在于，步驟S6中，以數字代表非目標物種對標記物的干擾強度，具體是：“1”代表具有絕對特異性的非目標物種，“2”代表弱干擾非目標物種，“3”代表中度干擾非目標物種，“4”代表對標記物產生顯著干擾的非目標物種。