[發明專利]一種稀土上轉換納米探針標記病毒的構建方法

在審

• 申請號: 202010225550.9
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111363725A
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 常津;龐高舉;王漢杰;張英英;潘惠卓
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;C09K11/02
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 程小艷

本發明公開一種稀土上轉換納米探針標記病毒的構建方法，包括如下步驟：1)包膜生物素化的流感病毒的制備；2)鏈霉親和素化稀土上轉換納米探針的合成；3)利用鏈霉親和素化稀土上轉換納米探針標記包膜生物素化的病毒。制備的稀土上轉換納米探針可與包膜生物素化的仙臺病毒結合，實現病毒包膜的標記。本發明的病毒包膜標記技術，可實現90％的病毒標記效率，稀土上轉換納米探針在980nm近紅外光激發下可發射波長540nm的綠色熒光，可用于在共聚焦顯微鏡下觀察。

技術領域

本發明屬于生物技術和材料技術領域，具體涉及一種稀土上轉換納米標記病毒的構建方法。

背景技術

目前標記病毒的方法主要利用熒光蛋白、有機染料及量子點納米顆粒，但這些標記方法存在一定的局限性：如熒光蛋白表達周期較長、操作步驟繁瑣、標記病毒后對其活性影響較大，且熒光蛋白自身熒光偏弱、易光漂，不利于進行長期示蹤；有機熒光染料發射光譜寬、光穩定性較差，長時間實時熒光監測相對困難；量子點應用于活體病毒示蹤時，仍存在可見光穿透性差、熒光壽命短及背景噪音高等局限。上轉換發光材料是一種吸收長波長光而發射出短波長光的一種材料，具有良好的組織穿透性。與傳統的生物熒光探針相比，稀土上轉換納米粒子發光亮度高、熒光壽命長(毫秒量級)、光穩定性好、抗漂白性強、穿透深度深、無背景熒光干擾，更適用于病毒標記。我們以流感病毒為例，研發一種利用稀土上轉換納米探針標記流感病毒包膜的方法，這種方法具備良好的標記效率，更方便應用于后續活體的病毒侵染機制探討等研究。

發明內容

本發明為克服現有技術的缺陷，提出了一種具有高標記效率的一種稀土上轉換納米顆粒標記流感病毒的方法。包括如下步驟：

1)包膜生物素化的流感病毒的制備；

2)鏈霉親和素化稀土上轉換納米探針的合成；

3)利用鏈霉親和素化稀土上轉換納米探針標記包膜生物素化的流感病毒。

所述步驟1)中包膜生物素化的流感病毒制備的具體步驟：

(1)在直徑10cm的細胞培養皿中培養MDCK細胞，向培養基中加入DSPE-PEG2000-Biotin試劑(終濃度為5μg/ml)，將培養皿置于37℃二氧化碳孵箱中培養18-24h。

(2)當培養皿中細胞密度生長至80-90％時，棄去培養基，用無血清培養基清洗細胞2次除去殘余血清，加入5ml無血清培養基和10μl流感病毒濃縮液，混勻后置于37℃二氧化碳孵箱中孵育2h，每半個小時輕搖培養皿。

(3)孵育完成后棄去上清，加入含2％FBS和DSPE-PEG2000-Biotin的完全培基。將培養皿置于37℃二氧化碳孵箱中培養48-72h。

(4)至細胞死亡50％時，收集細胞和上清于離心管中，在-80℃冰箱和常溫環境中反復凍融3次使細胞完全破碎。使用0.22μm濾膜過濾后4℃3000rpm離心30min除去細胞碎片。

(5)將濾液加至預先裝有2ml 20％蔗糖溶液的超速離心管中，100000g離心2h后棄去上清。加入300μl PBS溶液重懸沉淀，即可獲得包膜生物素化的流感病毒。

所述步驟2)鏈霉親和素化稀土上轉換納米探針合成的具體步驟：

(1)表面羧基化稀土上轉換納米顆粒由北大合作實驗室提供。制備1mg/ml稀土上轉換納米顆粒，取100μl向其中加入EDC和NHS各2mg，旋轉過夜后12000rpm離心20min，棄上清。

(2)加入100μl ddH2O重懸沉淀，加入50μl 1mg/ml鏈霉親和素，旋轉混勻2h。

(3)反應完成后12000rpm離心20min，棄上清，加入100μl ddH2O重懸即獲得鏈霉親和素化的稀土上轉換納米探針。