[發(fā)明專利]噬菌體裂解酶Lysep3在制備廣譜抗菌藥物中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010225517.6
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111420037B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王建華;閆偉;滕達(dá);毛若雨;楊娜;王秀敏;郝婭;馬炫炫
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
• 主分類號: A61K38/47
• 分類號: A61K38/47;A61P31/04;C12N9/24;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明提供噬菌體裂解酶Lysep3在制備廣譜抗菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)Lysep3對革蘭氏陽性菌具有較好的抑制效果，同時在外膜滲透劑的聯(lián)合作用下對多種細(xì)菌具有明顯的抑制作用，且具有較低的對小鼠紅細(xì)胞的溶血活性以及對鼠源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明以天然噬菌體裂解酶Lysep3為模板，通過優(yōu)化裂解酶Lysep3基因序列，構(gòu)建特異表達(dá)載體，實現(xiàn)了裂解酶Lysep3在真核表達(dá)系統(tǒng)(畢赤酵母)中的表達(dá)，并建立完善了蛋白純化體系，可實現(xiàn)噬菌體裂解酶Lysep3的規(guī)模化生產(chǎn)，用于抗菌藥物、飼料添加劑等領(lǐng)域，具有重要的應(yīng)用價值和廣闊的市場前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及噬菌體裂解酶Lysep3在制備廣譜抗菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

中國是畜禽生產(chǎn)和產(chǎn)品消費(fèi)大國，同時也是世界飼料生產(chǎn)和抗生素使用大國，2010年使用量約占全球消耗量的23％，到2030年有可能增長至30％(Van Boeckel et al.,2015)。畜牧業(yè)中抗生素的使用對促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展發(fā)揮了重大作用，但是大量抗生素的使用，也導(dǎo)致畜牧養(yǎng)殖業(yè)中病原菌耐藥性的泛濫。研究表明，尤其是在亞洲等不發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，已經(jīng)有三分之一的常用藥物對雞病原菌無效，四分之一的常用抗生素對豬無明顯治療效果(Thomas Van Boeckel et al.,2019)。人類、動物和環(huán)境之問的活動與聯(lián)系，加強(qiáng)了耐藥細(xì)菌及耐藥基因的傳播(Pranting et al.,2008；Pollard et al.,2012)。多重耐藥，甚至“超級耐藥”細(xì)菌的出現(xiàn)和流行，不僅影響到動物疾病的有效防治而且可能會危及食品和公共安全。

飼用抗生素的禁用已經(jīng)在全球范圍內(nèi)成為行業(yè)和社會共識。歐盟、日本、韓國等國家已分別于2006年、2008年和2011年禁止在飼料中使用抗生素促生長劑。2017年6月，《全國遏制動物源細(xì)菌耐藥行動計劃(2017-2020年)》明確提出推進(jìn)獸用抗菌藥物規(guī)范化、減量化使用，要實施“退出行動”，推動促生長用抗菌藥物逐步退出，鼓勵研制新型動物專用抗生素。2018年4月20日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布通知將開展獸用抗菌藥使用減量化行動試點。以期應(yīng)對動物源細(xì)菌耐藥挑戰(zhàn)，保障養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全。禁止飼用抗生素是大勢所趨，因此，開發(fā)新的抗生素替代品迫在眉睫。

噬菌體裂解酶(bacteriophage endolysins)是一種雙鏈DNA噬菌體在侵染宿主菌后期編碼合成的酶類物質(zhì)，可以在穴蛋白(holin)的協(xié)助下從宿主菌內(nèi)部殺滅細(xì)菌，釋放子代噬菌體。噬菌體及裂解酶最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)初期，最近由于抗生素濫用所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性泛濫現(xiàn)象愈加嚴(yán)重，逐步受到研究者的關(guān)注(Fernando L et al.,2019)。目前研究普遍認(rèn)為噬菌體裂解酶作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)其作用位點的不同可分為四類：葡糖苷酶、內(nèi)肽酶、酰胺酶和轉(zhuǎn)糖激酶(Michael J.Love et al.,2018)。由于裂解酶作用位點較為保守，所以相較于抗生素而言不易產(chǎn)生耐藥性，同時噬菌體作為自然界中存在最為豐富的微生物之一，為裂解酶提供了充足的來源保障，因此，裂解酶被視作一種有潛力的抗生素替代品。但是目前已經(jīng)分離鑒定出來的裂解酶仍然不足以滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)中的需求，同時天然裂解酶的生產(chǎn)成本較高、殺菌效果和機(jī)理不明確，因此對天然裂解酶的生產(chǎn)工藝加以優(yōu)化改造以及對其應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步研究也是目前裂解酶產(chǎn)品開發(fā)的難點和希望所在。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供噬菌體裂解酶Lysep3在制備廣譜抗菌藥物或組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供在重組畢赤酵母中高效表達(dá)噬菌體裂解酶Lysep3的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供噬菌體裂解酶Lysep3在制備廣譜抗菌藥物或組合物中的應(yīng)用，其中，所述菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌；

噬菌體裂解酶Lysep3包含如下的氨基酸序列或由其組成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或