[發明專利]噬菌體裂解酶Lysep3在制備廣譜抗菌藥物中的應用

有效

• 申請號: 202010225517.6
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111420037B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 王建華;閆偉;滕達;毛若雨;楊娜;王秀敏;郝婭;馬炫炫
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: A61K38/47
• 分類號: A61K38/47;A61P31/04;C12N9/24;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.聚核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

2.含有權利要求1所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料為重組DNA、表達盒、轉座子、質粒載體、病毒載體或工程菌或轉基因細胞系。

3.重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含誘導型啟動子以及位于啟動子下游的SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，其中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端具有酵母Kex2基因表達產物切割識別序列AAGAGA。

4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述重組表達載體的出發載體為pPICZαA。

5.畢赤酵母轉化子，其特征在于，所述畢赤酵母轉化子是將權利要求4所述的重組表達載體進行線性化后轉化到畢赤酵母X-33中構建而成。

6.權利要求5所述畢赤酵母轉化子在發酵生產噬菌體裂解酶Lysep3中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

1)種子液的制備：從YPD平板挑取畢赤酵母轉化子單菌落，接種于含100μg/ml zeocin的10mL YPD液體培養基中，29℃，250rmp，搖床培養18-24h，以1％接種量接種于200mL YPD液體培養基中，29℃，250rmp，搖床培養16-18h，至OD_600nm值為5-7，即得種子液；

2)發酵培養：25℃～29℃下，按10％的接種量將上述種子液加入1.8L基礎鹽培養基中，調pH值至4.0-6.0，加入9.6ml PMT1和200mL 45％葡萄糖溶液，通氣量維持在8～9vvm，轉速為800rpm，溶氧維持在10％以上；

3)飼喂碳源：觀測溶氧值開始緩慢下降后突然上升至80％以上，開始流加50％葡萄糖溶液，流加速度為12～24mL/L/min，連續流加6～8h，轉速上調至1000rpm；

4)甲醇誘導：流加葡萄糖后，饑餓半小時，開始補加100％甲醇，由第一小時的流速1mL/L/min逐漸增加到第六小時的6mL/L/min，轉速上調至1100rpm，pH上調至5.5，控制溶氧在20％以上，至發酵結束；

5)目的蛋白的純化：包括對發酵液依次進行透析脫鹽、冷凍干燥、復溶和離子交換層析的步驟；

其中，步驟2)中使用的基礎鹽培養基配方為：100g NH₄H₂PO₄、40g K₂SO₄、30gMgSO₄·7H₂O、12g KH₂PO₄、0.8g CaSO₄和3g KOH，加水充分溶解后定容至1.8L。