[發明專利]阿爾茨海默病大腦皮質類器官及其獲得方法、應用

在審

• 申請號: 202010225151.2
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111334477A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 范文娟;鄧錦波;陳旭東
• 申請（專利權）人: 漯河醫學高等專科學校
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及阿爾茨海默病大腦皮質類器官及其獲得方法、應用，利用慢病毒感染，將APP與PS1突變基因轉入小鼠誘導性多能干細胞，建立能夠穩轉APP與PS1突變基因的iPSCs系。隨后通過3D培養，建立成熟穩定的小鼠阿爾茨海默病大腦皮質類器官培養體系，不但能夠幫助研究者們進一步了解人體發育的機制，也可以用作疾病模型或者藥物篩選平臺。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及阿爾茨海默病大腦皮質類器官及其獲得方法、應用。

背景技術

類器官培養(organoid culture)是最近幾年隨著干細胞領域的飛速發展，最新出現的一種人工組織培養技術。它主要是通過3D培養的方式，將干細胞從單個細胞生成的一種復雜的、類似活體組織的結構。在應用方面，涉及人造器官領域，以及研究活體組織發生、疾病形成的機理、藥物實驗以及組織替代療法等方面。

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是通過轉入一些干細胞轉錄因子，將已經分化成熟的體細胞重編程得到的一類多能干細胞。它在生物學特性方面與胚胎干細胞類似，可以向多個方向的體細胞分化。與胚胎干細胞相比，iPS細胞取材方便，來源廣泛，不具有免疫排斥反應及倫理道德等問題，是類器官培養最為理想的種子細胞。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種最常見的呈進行性發展的神經退行性疾病，淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)與早老蛋白(presenilin，PS)基因突變是導致家族性AD發生的主要因素。

長期以來AD轉基因動物模型一直是探索AD病理生理機制的主要研究工具，然而AD轉基因動物模型存在建模難度大，飼養周期長，體內多基因之間相互干擾等各種問題，使得研究某種關鍵病理事件的發生比較困難。目前，在國內的研究中，尚未見到大腦皮質類器官培養尤其是阿爾茨海默病大腦類器官培養相關的研究報道。

發明內容

有鑒于此，本發明通過在iPSCs內過表達APPSwe/Ind(APP)及PSEN1(PS1)突變基因，獲得穩轉APP與PS1突變基因的iPSCs系，利用其培養AD大腦皮質類器官，建立一種能快速產生AD病理表型的實驗模型。

本發明提供了一種阿爾茨海默病大腦皮質類器官的獲得方法，包括以下步驟：

S1，通過慢病毒轉染的方式，將APPSwe/Ind-PSEN1雙突變基因轉入小鼠iPSCs，得到含雙突變基因的iPSCs；

S2，將含雙突變基因的iPSCs傳代培養，后利用差速貼壁法去除飼養層細胞，得到純化的iPSCs；

S3，將純化的iPSCs接種于細胞培養板a上在第一培養基中培養，每2天半量換液，培養4-6天后，將iPSCs形成的擬胚體轉移到細胞培養板b上在第二培養基中培養，每兩天換液一次，培養6-8天時，包被擬胚體周邊伸出的半透明的神經上皮芽狀突起，換用第三培養基低速搖動培養，每兩天換液一次，持續培養60-65d后，收取標本，即得到阿爾茨海默病大腦皮質類器官；

所述第一培養基為：無LIF的iPSCs無血清培養基；

成分為：knockout DMEM(Gibco，10829018)；質量分數20％的KSR(Gibco，10828028)；100X×L-GlutaMax(Gibco，3505006)；100×NEAA(Gibco，11140-050)；1000X×2-ME(10mM)(2-Mercaptoethanol，Sigma，M3148)。

所述第二培養基為：神經上皮分化培養基；