[發(fā)明專利]阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官及其獲得方法、應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010225151.2
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111334477A
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 范文娟;鄧錦波;陳旭東
• 申請（專利權(quán)）人: 漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/867;C12Q1/02
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式，將APPSwe/Ind-PSEN1雙突變基因轉(zhuǎn)入小鼠iPSCs，得到含雙突變基因的iPSCs；

S2，將含雙突變基因的iPSCs傳代培養(yǎng)，去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，得到純化的iPSCs；

S3，將純化的iPSCs接種于細(xì)胞培養(yǎng)板a上在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2天半量換液，培養(yǎng)4-6天后，將iPSCs形成的擬胚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板b上在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每兩天換液一次，培養(yǎng)6-8天時，包被擬胚體周邊伸出的半透明的神經(jīng)上皮芽狀突起，換用第三培養(yǎng)基低速搖動培養(yǎng)，每兩天換液一次，持續(xù)培養(yǎng)60-65d后，收取標(biāo)本，即得到阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官；

所述第一培養(yǎng)基為：無LIF的iPSCs無血清培養(yǎng)基；

成分為：knockout DMEM；質(zhì)量分?jǐn)?shù)20％的KSR8；100×L-GlutaMax；100×NEAA；1000×2-ME，2-ME的濃度為10mM；

所述第二培養(yǎng)基為：神經(jīng)上皮分化培養(yǎng)基；

成分為：DMEM-F12；100×N2 supplement；100×L-GlutaMax；100×NEAA；MouseNoggin；

所述第三培養(yǎng)基為：大腦皮質(zhì)分化培養(yǎng)基，

成分為：DMEM/F12；Neurobasal medium；50×B27；100×N2 supplement；100×L-GlutaMax；100×NEAA；100×P/S；2μg/L Mouse IGF-I。

2.如權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，S3中，純化的iPSCs濃度為1×10⁴個/100μl。

3.如權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，S3中，細(xì)胞培養(yǎng)板a為低黏附U型底96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)板b為低黏附6孔板。

4.如權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，S3中，第一培養(yǎng)基中添加有Rock抑制劑Y27362。

5.如權(quán)利要求4所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，所述Rock抑制劑Y27362的終濃度為50μM。

6.如權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，S3中，利用Matrigel基質(zhì)膠包被擬胚體周邊伸出的半透明的神經(jīng)上皮芽狀突起。

7.如權(quán)利要求1所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官的獲得方法，其特征在于，S3中，培養(yǎng)條件均為37℃、體積分?jǐn)?shù)5％的CO₂、平衡濕度。

8.利用權(quán)利要求1-7任一項所述的方法獲得的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官。

9.如權(quán)利要求8所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官作為阿爾茨海默病模型的應(yīng)用。

10.如權(quán)利要求8所述的阿爾茨海默病大腦皮質(zhì)類器官作為阿爾茨海默病治療藥物篩選平臺的應(yīng)用。