[發(fā)明專利]一種適用于PCR實驗的免提取念珠菌核酸樣本的制備方法

有效

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• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111394347B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 賀政新
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 孟玉寒

一種適用于PCR實驗的免提取念珠菌核酸樣本的制備方法為酶裂解和熱裂解相結合的方式，包括如下步驟：酶裂解液的配制：將酵母裂解酶lyticase、蝸牛酶、β?巰基乙醇混合，并添加生理鹽水至混合液體積為100μL；酶裂解：將念珠菌標本置于eppendorf管中，以PBS洗滌后離心，去除上清，向其中加入步驟a配制的酶裂解液100μL，水浴加熱裂解；熱裂解：將完成酶裂解水浴的eppendorf管置金屬浴中，加熱裂解，念珠菌樣本經(jīng)過酶裂解和熱裂解后，10000轉(zhuǎn)/分鐘低溫高速離心10分鐘，上清即為制備好的念珠菌DNA樣本。本發(fā)明采用酶裂解和熱裂解相結合的方式制備DNA樣本，裂解時間短，免除了提取DNA過程，使裂解產(chǎn)物簡單處理后可直接用于PCR實驗，提高了PCR擴增的靈敏度。

技術領域

本發(fā)明涉及一種適用于PCR實驗的免提取念珠菌核酸樣本的制備方法，屬于生物技術領域。

背景技術

人類面臨侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis,IC)的挑戰(zhàn)越來越大，許多地區(qū)IC發(fā)病率持續(xù)上升，即使患者接受了抗真菌治療，死亡率亦高達40％。尤其是近期引起全球關注的耳念珠菌感染，美國CDC已將其列入緊急威脅名單。據(jù)通報，全美耳念珠菌感染病例達587宗，近50％的感染者在90天內(nèi)死亡。早期檢測是降低IC病死率的關鍵。

目前實驗室檢測主要采用包括微生物培養(yǎng)的傳統(tǒng)檢驗手段、以及近年來發(fā)展較快的血清學檢測技術，后者成為傳統(tǒng)IC檢測方法的重要補充。這些技術主要包括G試驗、GM試驗、GXM試驗(隱球菌莢膜多糖)、Mn試驗(念珠菌甘露聚糖)以及各種屬特異性Ig M、Ig G抗體檢測等。真菌病血清學檢測的缺點在于：①無法實現(xiàn)精確的菌種鑒定；②容易出現(xiàn)假陽性結果；③部分人的檢測準確性、敏感性有較大的不確定性；④不同循環(huán)抗體和抗原之間可能存在交叉反應。

隨著分子生物學和生物傳感器技術的不斷進步，新的分子檢測平臺不斷涌現(xiàn)，這些技術包括：全稱基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)、傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應(PCR)，恒溫擴增、測序等。與傳統(tǒng)方法以及質(zhì)譜平臺相比，以PCR、恒溫擴增為代表的核酸診斷因其高靈敏度、高特異性及檢測時間短，為不易培養(yǎng)病原真菌的快速檢測和鑒定、抗真菌藥物抗性檢測以及宿主組織體液的直接性快速檢測帶來了希望，是未來真菌感染性疾病診斷的新趨勢，具有重大的發(fā)展前景。

核酸診斷大體分為臨床樣本DNA樣本制備和核酸分析兩個階段。臨床樣本DNA制備的質(zhì)量和濃度是核酸擴增檢測的首要保障。不同于細菌、病毒、人類細胞等，真菌細胞壁由幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白組成，最為堅固厚實，難以通過簡單的物理或者化學方法去除。所以真菌DNA樣本制備難度極大，提取尚未有標準化流程以及行業(yè)標準，是分子診斷領域的研發(fā)關鍵和行業(yè)難點，也是真菌感染核酸診斷發(fā)展滯后的主要原因。另外DNA制備也是真菌檢測假陽性的重要原因之一，研究發(fā)現(xiàn)，有3.3％假陽性由DNA提取過程引起。

念珠菌細胞壁由幾丁質(zhì)、葡聚糖、纖維素、蛋白質(zhì)及糖蛋白等構成，不同的多糖鏈互相纏繞，蛋白質(zhì)及類脂等嵌于其中，使其細胞壁強度很高，是念珠菌樣本制備時DNA充分釋放的最大障礙。既往研究常用的破壁方法有熱酸性酚裂解法，酸洗玻璃珠裂解法，酶法，液氮研磨法等。這些方法的主要缺點有三：①操作繁瑣復雜，有的方法需要特殊介質(zhì)如液氮等，不適合實驗室開展和推廣；②念珠菌裂解率不高；③完成裂解后使用試劑盒提取DNA，延長了實驗時間，進一步造成DNA損失。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術弊端，提供一種適用于PCR實驗的免提取念珠菌核酸樣本的制備方法，本發(fā)明采用酶裂解和熱裂解相結合的方式制備DNA樣本，裂解時間短，免除了提取DNA過程，使裂解產(chǎn)物簡單處理后可直接用于PCR實驗，提高了PCR擴增的靈敏度。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種適用于PCR實驗的免提取念珠菌核酸樣本的制備方法，所述制備方法為酶裂解和熱裂解相結合的方式，包括如下步驟：