[發明專利]一種羅非魚及其遺傳多樣性的微衛星鑒別引物和方法

在審

• 申請號: 202010224719.9
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111286547A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 簡偉業;趙金良;唐首杰
• 申請（專利權）人: 茂名市偉業羅非魚良種場;上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州浩泰知識產權代理有限公司 44476
• 代理人: 李巍

1.一種羅非魚及其遺傳多樣性的微衛星鑒別引物，其特征在于，所述微衛星鑒別引物有15對，分別為：UNH904、GM532、UNH846、UNH1007、HM370073、HM370078、HM370085、HM370111、UNH878、UNH896、UNH901、GM047、GM294、GM323、GM578，所述微衛星鑒別引物是從GenBank數據庫中檢索已發布的尼羅羅非魚微衛星位點50個中使用Primer5.0軟件設計引物篩選出來的。

2.一種羅非魚及其遺傳多樣性的微衛星鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)材料選取：分別選取“新吉富”羅非魚選育系F13、F14和F15，其中F13樣本數為29尾，F14、F15樣本數均為30尾，剪取每尾標本尾鰭，編號后于95％乙醇中保存備用；

(2)基因組DNA的提取：使用組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒提取步驟(1)中每尾標本尾鰭的基因組DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，對通過檢測的DNA提取物進行編號，于-40℃冰箱中保存備用；

(3)微衛星引物篩選：從GenBank數據庫中檢索已發布的尼羅羅非魚微衛星位點50個中使用Primer5.0軟件設計引物篩選15對有效擴增的微衛星引物，分別為：UNH904、GM532、UNH846、UNH1007、HM370073、HM370078、HM370085、HM370111、UNH878、UNH896、UNH901、GM047、GM294、GM323、GM578；

(4)微衛星引物PCR反應、電泳檢測和染色：PCR擴增反應總體積為10μL，包含1L基因組DNA模板(20ng/μL)，正、反向引物各0.5L(0.5μM)，5L緩沖液(0.2mM dNTPs，1.5M MgCl2，0.5M Taq DNA聚合酶)，3L無菌去離子水；PCR產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，凝膠濃度為8％，電泳緩沖液為1×TBE；電泳完成后利用快速銀染法進行染色，觀察PCR產物擴增情況；

(5)數據分析：根據凝膠上DNA泳動距離進行判斷，如果電泳條帶表現為一條，且泳動距離一致，則認為該等位基因座是純合的；如果表現為兩條帶，則認為該座位為雜合；利用AlphaEaseFC 4.0軟件估算電泳條帶中的每一條帶的分子量大小，按大小轉化成字母，利用POPGENE軟件(Yeh et al,1997)計算每個群體的等位基因數(Na)、有效等位基因數(NE)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(HE)；根據Nei(1972,1978)的方法計算群體間遺傳相似系數和群體間遺傳距離；利用ARLEQUIN 3.5軟件(Excoffier et al,2010)，計算群體遺傳分化指數FST，估計群體間的遺傳分化，分析群體內和群體間的分子方差(Analysis of MolecularVariance,AMOVA)，用排列檢測法(permutation test)檢測FST的顯著性(重復次數為1000)；并根據下式計算多態信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)：

式中：pi和pj分別為第i和第j個等位基因的頻率，n為等位基因數目。

3.根據權利要求2所述的羅非魚及其遺傳多樣性的微衛星鑒別方法，其特征在于，步驟(4)中PCR的擴增程序：94℃預變性4min，接下來進行35個循環，每個循環包括94℃變性30s，退火45s(各對引物的特定退火溫度見表1)，72℃延伸1min；35個循環后，72℃延伸10min，PCR產物在4℃保存待檢測。