[發明專利]適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法

在審

• 申請號: 202010224199.1
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111197044A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 楊金玉;陳蕾蕾;陳相艷;楊煥蝶;王易芬;劉孝永;王軍華;張彥昊
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農產品研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京智橋聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11560
• 代理人: 江莉莉

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法。適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于：用生理鹽水對金黃色葡萄球菌洗滌，在生理鹽水中對該菌體進行沸水浴處理，再采用溶菌酶對菌體裂解處理，溶菌酶處理的時間大于或等于12h，然后用天根試劑盒進行基因組的提取。采用本發明的方法對金黃色葡萄球菌基因組進行提取，能顯著的提高金黃色葡萄球菌的破壁效果，達到提高基因組濃度的目的。并且通過本發明的方法，使得金黃色葡萄球菌基因組濃度顯著提高，A260/A280和A260/A230的值達到了1.8~2.0，符合標準物質的要求。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法。

背景技術

食源性病原菌是可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細菌，威脅著人類的健康，能引起嚴重的食品安全問題。食品致病菌種類較多，常見的有致瀉大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌等。建立準確、靈敏、快速、特異性的檢測方法用于食品致病菌的檢測，對預防和控制食品微生物食物中毒事件的發生有著重要的作用。

以上的病菌中，金黃色葡萄球菌也是引起食物中毒的重要病原菌，也是個世界性衛生難題。在當下微生物污染引起的疾病暴發模式也從局部范圍集中式小暴發向全社會范圍以散點病例組成的大暴發轉變，為有效識別大暴發，快速準確的食品病原菌檢測方法迫在眉睫。

傳統培養法耗時長，已不能滿足目前食源性病原菌的檢測。因此目前發展形成了多種快速檢測方法，這些方法主要是基于分子生物學的聚合酶鏈反應PCR法、環介導等溫擴增法和基于免疫學的快速檢測方法-酶聯免疫吸附法等。目前基于分子生物學最常用的有普通PCR法、熒光定量PCR法和近年來興起的數字PCR法等。這些檢測方法的共同點是需要DNA標準物質作為反應的模板，模板可以為病原菌的基因組DNA或者是攜帶特征毒力基因的質粒DNA。DNA屬于生物標準物質，生物標準物質不同于其它標準物質，具有生物活性等特點。目前，食品微生物類參考物質在全球范圍內整體較為匱乏，同時由于生物安全問題，這些參考物質在國際共享過程中出現許多困難。因此建立食源性微生物檢測即用型基因組核酸標準物質，將解決食品微生物檢測核酸參考物質缺失這一關鍵問題。

發明內容

為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種能有效的提高金黃色葡萄球菌的破壁效果，達到提高基因組濃度的目的的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法。

革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌分別按照OMEGA和天根的試劑盒提供的標準提取方法提取的基因組濃度均不高，并且天根試劑盒提取的基因組A260/A230比值較低，為1.2。這可能是由于革蘭氏陽性菌細胞壁結構較為復雜，難以破壁，導致提取的基因組濃度較低。

本發明以4種常見的食源性病原菌作為研究對象，結合國產天根細菌基因組提取試劑盒，針對不同的菌株，相應地改進了細菌基因組的提取方法，使4種食源性病原菌的基因組樣品均符合核酸標準樣品的質量要求，為后期大量制備奠定了基礎，對于食品檢測具有非常重要的意義。

適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，最核心的步驟是，適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于：用生理鹽水洗滌金黃色葡萄球菌菌體，然后在生理鹽水中對該菌體進行沸水浴處理，冷卻至室溫，再采用溶菌酶對菌體進行裂解，溶菌酶處理的時間大于或等于12h，然后用天根試劑盒進行基因組的提取。

上述的金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌。

溶菌酶處理的時間達到12h時，沸水浴處理的時間為3～7min；優選的為5min。

生理鹽水洗滌后，金黃色葡萄球菌基因組濃度為193.3ng/μL，且A260/A280和A260/A230的值均在1.8～2.0之間。

上述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，包括以下的步驟：