[發明專利]適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法

在審

• 申請號: 202010224199.1
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111197044A
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 楊金玉;陳蕾蕾;陳相艷;楊煥蝶;王易芬;劉孝永;王軍華;張彥昊
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院農產品研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京智橋聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11560
• 代理人: 江莉莉

1.適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于：用生理鹽水洗滌金黃色葡萄球菌菌體，然后在生理鹽水中對該菌體進行沸水浴處理，冷卻至室溫，再采用溶菌酶對菌體進行裂解，溶菌酶處理的時間大于或等于12h，然后用天根試劑盒進行基因組的提取。

2.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于：所述的金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌。

3.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于：溶菌酶處理的時間達到12h時，金黃色葡萄球菌基因組濃度為66.1~113.3 ng/μL，且A260/A280和A260/A230的值均在1.7~2.0之間。

4.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于，金黃色葡萄球菌基因組濃度為193.3ng/μL，且A260/A280和A260/A230的值均在1.8~2.0之間。

5.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于，沸水浴處理的時間為3~7min。

6.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，包括以下的步驟：

（1）取出甘油管保存的菌株，快速解凍，以1%的接種量接種到已滅菌的BHI肉湯培養基中，置于37℃搖床培養12 h；

（2）培養過夜的金黃色葡萄球菌菌懸液離心棄上清后，用生理鹽水洗滌金黃色葡萄球菌菌體，然后對該菌體進行沸水浴處理5min，冷卻至室溫，再采用溶菌酶對菌體進行裂解12h以上，最后用天根試劑盒進行基因組的提取。

7.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，包括以下的步驟：

（1）取出甘油管保存的菌株，快速解凍，以1%的接種量接種到已滅菌的BHI肉湯培養基中，置于37℃搖床培養12 h；

（2）將培養好金黃色葡萄球菌菌懸液離心棄上清后，用生理鹽水洗滌金黃色葡萄球菌菌體3次，然后取該菌體置于生理鹽水中進行沸水浴處理3~7min，冷卻至室溫，加入105~115μl緩沖液、65~75 μl溶菌酶溶液，于35~39℃下處理10~14 h；加入3.5~4.5 μl 濃度為100mg/ml 的RNase A溶液，振蕩12~18s，室溫放置3~7 min；

（3）向（2）中的溶液加入蛋白酶K溶液、緩沖液GB混勻后于65~75oC下放置8~12min，加無水乙醇，充分振蕩混勻12~18 s；將全部的溶液加入離心柱中離心后棄流出液；經過漂洗、洗脫后得到細菌基因組DNA。

8.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于，（2）中，加入110 μl緩沖液、70 μl溶菌酶溶液，于37℃下處理12 h；

所述的緩沖液為20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton；

溶菌酶溶液的濃度為50 mg/ml。

9.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，其特征在于，

（3）向（2）中的溶液加入蛋白酶K溶液、緩沖液GB混勻后一直于70oC下放置10min，加無水乙醇，充分振蕩混勻15s；將全部的溶液加入離心柱中離心后棄流出液；經過漂洗、洗脫后得到細菌基因組DNA。

10.如權利要求1所述的適用于金黃色葡萄球菌基因組的試劑盒提取方法，包括以下的步驟：

（1）取出甘油管保存的菌株，快速解凍，以1%的接種量接種到已滅菌的BHI肉湯培養基中，置于37℃搖床培養12 h；

（2）將培養好金黃色葡萄球菌菌懸液離心棄上清后，用生理鹽水洗滌金黃色葡萄球菌菌體3次，然后取該菌體置于生理鹽水中進行沸水浴處理5min，冷卻至室溫，加入110 μl緩沖液、70 μl溶菌酶溶液，于37℃下處理12h；加入4 μl 濃度為100 mg/ml 的RNase A溶液，振蕩15s，室溫放置5min；

（3）向（2）中的溶液加入蛋白酶K溶液、緩沖液GB混勻后于70oC下放置10min，加無水乙醇，充分振蕩混勻15s；將全部的溶液加入離心柱中離心后棄流出液；經過漂洗、洗脫后得到細菌基因組DNA。