[發(fā)明專利]人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應(yīng)液與試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010224158.2
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111235240A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許少飛;羅景燕;何繼謙;張鈺瑩;賴炳權(quán)
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州永諾生物科技有限公司;廣東永諾醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州厚海專利商標代理事務(wù)所(普通合伙) 44662
• 代理人: 梁桂萍

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤指一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應(yīng)液與試劑盒，所述的試劑盒包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液包括PCR反應(yīng)預(yù)混液、上游引物Pri?F1、下游引物Pri?R1、野生型探針和突變型探針；本發(fā)明采用的引物以及探針的終濃度及特異性都尤其適用于微滴式數(shù)字PCR檢測中，采用的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)進行檢測，具有更高的靈敏度和特異性、準確性，通過本發(fā)明配制的反應(yīng)液或試劑盒，可提高了檢測靈敏度、提高檢測的準確率，為臨床樣本提供快速、準確的輔助用藥指導(dǎo)，對于臨床上預(yù)后觀察及微量病變樣本的檢測提供更加有利的手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤指一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應(yīng)液與試劑盒。

背景技術(shù)

BRAF基因定位在7號染色體上，編碼B-raf蛋白，其參與絲蛋白激酶(MAPK)通路中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，BRAF基因發(fā)生突變后其所編碼B-raf蛋白的氨基酸發(fā)生改變，造成BRAF激酶持續(xù)性激活，該持續(xù)性激活信號傳導(dǎo)至下游信號通路導(dǎo)致細胞無限制增殖和分化，促使腫瘤細胞增長和進一步惡化。BRAF基因在多數(shù)癌癥都存在不同比例的突變，其中在惡性黑色素瘤中突變發(fā)生率可高達70％，甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)直腸癌和漿液性卵巢癌等都有著不低的突變發(fā)生率，在其他如肺癌、膠質(zhì)瘤、胃癌和肝癌等癌癥中雖然突變發(fā)生率不高，但仍不能忽視對BRAF基因突變的篩選治療。

目前，已鑒定在BRAF基因中存在多達30多種形式的突變，但絕大多數(shù)突變頻率很低，其中最為顯著的是以15號外顯子上的V600E突變，所以對BRAF基因V600E位點進行檢測可以得到更精確突變檢出率，為結(jié)直腸癌治療提供更有效的治療建議。

目前常用的檢測BRAF基因V600E位點的技術(shù)主要有FISH、ARMS-PCR檢測、一代測序、NGS和IHC等，這些檢測方法都存在操作復(fù)雜、對實驗人員要求較高、檢測靈敏度不足和檢測周期長等缺點。例如一代測序以及NGS檢測成本高，需要配備相應(yīng)的人員進行分析；FISH、IHC需要經(jīng)驗豐富的實驗人員，還存在人為操作誤差。而微滴式數(shù)字PCR作為第三代PCR，能夠不依賴標準曲線對樣本進行準確的絕對定量，能夠把整個反應(yīng)分割成數(shù)萬個微滴反應(yīng)，避免抑制物的影響，更能挖掘出低頻率突變DNA片段。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明旨在公開一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤指一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應(yīng)液與試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的引物，根據(jù)人類15號外顯子上的BRAF基因V600E位點的突變區(qū)域進行針對性設(shè)計的特異引物，其特征在于，所述引物為：

以SEQ ID NO.1所示序列為上游引物Pri-F1的核苷酸序列；

SEQ ID NO.1：TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA

以SEQ ID NO.2所示序列為下游引物Pri-R1的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2：GACAACTGTTCAAACTGATGGGAC。

本發(fā)明提供一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的探針，其特征在于，所述探針包括針對人BRAF基因V600E位點的野生型探針和突變型探針；

以SEQ ID NO.3所示序列為野生型探針Pro-WT-VIC的核苷酸序列；

SEQ ID NO.3：5’-VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-MGB-NFQ-3’

以SEQ ID NO.4所示序列為突變型探針Pro-MUT-FAM的核苷酸序列；