[發明專利]人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應液與試劑盒

在審

• 申請號: 202010224158.2
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111235240A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 許少飛;羅景燕;何繼謙;張鈺瑩;賴炳權
• 申請（專利權）人: 廣州永諾生物科技有限公司;廣東永諾醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州厚海專利商標代理事務所(普通合伙) 44662
• 代理人: 梁桂萍

1.一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的引物，其特征在于，所述引物為：

以SEQ ID NO.1所示序列為上游引物Pri-F1的核苷酸序列；

以SEQ ID NO.2所示序列為下游引物Pri-R1的核苷酸序列。

2.一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的探針，其特征在于，所述探針包括針對人BRAF基因V600E位點的野生型探針和突變型探針；

以SEQ ID NO.3所示序列為野生型探針的核苷酸序列；

以SEQ ID NO.4所示序列為突變型探針的核苷酸序列。

3.使用權利要求1所述引物或權利要求2所述探針用于配制一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括PCR反應預混液、上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1、野生型探針和突變型探針。

4.根據權利要求3所述的一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應液，其特征在于，所述突變型探針和所述野生型探針的5’端標記不同的熒光報告基團，3’端標記非熒光淬滅基團并連接有MGB修飾基團。

5.根據權利要求3所述的一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應液，其特征在于，所述上游引物Pri-F1和下游引物Pri-R1的濃度為500～1000nM。

6.根據權利要求3所述的一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的PCR反應液，其特征在于，所述突變型探針和野生型探針的濃度為100～500nM。

7.一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權利要求3～6任一項所述的PCR反應液。

8.一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的試劑盒應用方法，其特征在于，所述的應用方法包括以下步驟：

1)提取DNA模板，濃度為10～50ng/μl；

2)配制PCR反應液：PCR預混液、20μM上游引物、20μM下游引物、10μM突變型探針、10μM野生型探針、ddH₂O；

3)配制PCR特異擴增反應體系；

4)將PCR特異擴增反應體系生成微滴；

5)進行數字PCR擴增，并通過軟件計算突變率。

9.根據權利要求8所述的一種人BRAF基因V600E位點突變檢測的試劑盒應用方法，其特征在于，所述步驟2)中，配制PCR反應液的份量包括：PCR預混液10μl，20μM上游引物1.8μl，20μM下游引物1.8μl，10μM突變型探針0.5μl，10μM野生型探針0.5μl，ddH₂O 3.4μl。