[發明專利]mOrange和vp28穿梭載體富集至鹵蟲無節幼體的方法

在審

• 申請號: 202010222429.0
• 申請日: 2020-03-26
• 公開（公告）號: CN111394381A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 賈睿;徐楊;彭穩;何培民
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/65
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 胡永宏

本發明提供了一種mOrange和vp28穿梭載體富集至鹵蟲無節幼體的方法，包括步驟：根據檢索到的mOrange和vp28的基因通過序列組合、設計得到mOrange和vp28融合基因，進行密碼子優化為優化后的mOrange和vp28融合基因；再和pRL489質粒連接，構建mOrange和vp28穿梭載體并轉入大腸桿菌，大腸桿菌在含0.5wt％甲醛的磷酸鹽溶液內滅活，最后將含有pRL489?vp28?mOrange質粒的大腸桿菌喂食到鹵蟲無節幼體內；本發明充分利用mOrange基因熒光特性，使得融合載體基因的表達易于檢測分析，并通過熒光標記物這一特性減少了繁瑣的分子、蛋白檢測，從而節約時間與成本。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種mOrange和vp28穿梭載體富集至鹵蟲無節幼體的方法。

背景技術

Gomez-Gil B將恩氟沙星和土霉素兩種抗菌劑單獨通過生物包封至鹵蟲無節幼體，通過富集1h、2h、3h、4h、8h和24h確定生物包封的最短時間，結果表明鹵蟲無節幼體可以在大約1-8h的時間段內生物包封最大濃度的顆粒，這取決于攝取的物質種類與濃度，且在此之后，由于生物體在攝取物質和廢物排泄之間達到平衡，因此可能不再生物包封物質。Matthew C證明了甲硝唑通過生物包封后的鹵蟲無節幼體，可用于治療易感染傳染病水生動物，有效避免了直接投放甲硝唑對嚙齒動物的致癌性、藻類細胞以及對水環境潛在藥物的毒性作用。

鹵蟲作為非選擇性過濾的動物，并提供一種理想的可溶性轉運藥品機制，通過生物包封可以進一步豐富鹵蟲的營養價值。前人的研究中富集的大多為抗生素等藥物，并未利用大腸桿菌等載體進行富集工作。

發明內容

針對現有技術中的不足，本發明的目的是提供一種mOrange和vp28穿梭載體富集至鹵蟲無節幼體的方法。本發明構建的熒光蛋白表達系統，能夠實現外源蛋白的長效、穩定表達，并且易于檢測。利用構建的熒光蛋白表達功能的重組質粒激活其下游熒光蛋白的表達，發出熒光，在鹵蟲無節幼體體內富集，從而可根據熒光蛋白表達的結果來觀察、確定藥物的傳遞位置及水平，進而為后續鹵蟲作為水產養殖餌料富集藥物的療效水平提供依據。

具體地，為達到上述目的，本發明的解決方案是：

一種mOrange和vp28穿梭載體富集至鹵蟲無節幼體的方法，其包括如下步驟：

(1)、根據GenBank上檢索到的mOrange和vp28的基因，經過序列組合、設計得到mOrange和vp28融合基因，其堿基序列為SEQ ID.NO.3，再進行密碼子優化，得到優化后的mOrange和vp28融合基因，其堿基序列為SEQ ID.NO.4；

(2)、步驟(1)的優化后的mOrange和vp28融合基因和pRL489質粒連接，構建mOrange和vp28穿梭載體并轉入大腸桿菌，得到含有pRL489-vp28-mOrange質粒的大腸桿菌；

(3)、將步驟(2)的含有pRL489-vp28-mOrange質粒的大腸桿菌喂食到鹵蟲無節幼體內。

其中，在步驟(1)中，本發明通過檢索GenBank中的已有數據，將mOrange熒光蛋白基因與vp28基因進行融合，再對兩端序列進行密碼子優化設計，從而保證其穩定的表達。

在步驟(2)中，大腸桿菌在含0.5wt％甲醛的pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液內滅活，無菌PBS反復沖洗后保證鹵蟲富集時存活。

作為本發明的一種優選實施例，步驟(1)中，mOrange的氨基酸序列為SEQID.NO.1。

作為本發明的一種優選實施例，步驟(1)中，vp28的氨基酸序列為SEQ ID.NO.2。

由于采用上述方案，本發明的有益效果是：