[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒全基因組捕獲方法、引物組以及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010219661.9
• 申請(qǐng)日: 2020-03-25
• 公開（公告）號(hào): CN111118226B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張滋婷;韓月婷;陳文兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京微未來科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京領(lǐng)科知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

本發(fā)明涉及一種超靈敏度新型冠狀病毒全基因組捕獲方法、引物組以及試劑盒，本發(fā)明需少量RNA便可方便快速的擴(kuò)增出新型冠狀病毒全基因組，可直接對(duì)接二代測(cè)序建庫試劑和三代測(cè)序平臺(tái)，獲得新型冠狀病毒全基因組序列。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及到一種新型冠狀病毒全基因組捕獲方法、引物組以及試劑盒。

背景技術(shù)

冠狀病毒為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，長度從2.6萬到3.2萬個(gè)堿基不等，根據(jù)血清型和基因組特點(diǎn)冠狀病毒亞科被分為α、β、γ、δ四個(gè)屬。SARS-CoV-2屬于β屬，全長29847bp。

自2020年1月26日以來，已有7個(gè)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品陸續(xù)通過國家藥品監(jiān)督管理局應(yīng)急審批，獲得上市批件。SARS-CoV-2鑒定試劑盒以熒光定量PCR方法為主，實(shí)踐顯示其檢測(cè)特異性高，成本低，操作方便。但是，該類試劑盒是根據(jù)已知病毒序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，因此只能鑒別已知病毒類型，不能鑒定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列變異，會(huì)導(dǎo)致引物和探針擴(kuò)增失敗，檢測(cè)敏感性降低，因此需要定期更換引物和探針，并重新進(jìn)行實(shí)際評(píng)估，而且應(yīng)用熒光定量PCR方法鑒定SARS-CoV-2假陰性情況經(jīng)常發(fā)生，甚至出現(xiàn)過6次檢測(cè)才有1次陽性的情況。

此外，基于宏基因組測(cè)序（metagenomics Next Generation Sequencing，簡(jiǎn)稱“mNGS”，又稱“宏基因組學(xué)”）的檢測(cè)試劑盒也已獲批，能夠鑒別診斷包括新型冠狀病毒在內(nèi)的其他冠狀病毒和呼吸道病原的感染，實(shí)現(xiàn)病毒序列的快速檢測(cè)。基于宏基因組新一代測(cè)序技術(shù)(mNGS) 不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，直接對(duì)臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠快速、客觀的檢測(cè)臨床樣本中的多種病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲），尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。隨著mNGS 技術(shù)平臺(tái)的完善和臨床研究的增多，mNGS在臨床上的運(yùn)用將越來越廣泛。2016年美國FDA認(rèn)可用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行微生物鑒定及耐藥毒力分析；2019年病原宏基因組學(xué)被寫入成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南。

測(cè)序指的是對(duì)基因的序列進(jìn)行判斷的一種方法。每個(gè)物種的基因控制生物性狀的表達(dá)，而測(cè)序是指對(duì)基因的序列進(jìn)行判斷。第二代測(cè)序（NGS）又稱為高通量測(cè)序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測(cè)序技術(shù)。目前測(cè)序技術(shù)已發(fā)展到第三代，第三代測(cè)序技術(shù)是指單分子測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序時(shí)，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。第三代測(cè)序技術(shù)也叫從頭測(cè)序技術(shù)，即單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序。近年，新一代測(cè)序技術(shù)（NGS）（也稱之為二代測(cè)序）和納米孔測(cè)序技術(shù)（Nanopore)(也稱之為三代測(cè)序）越來越多的應(yīng)用于未知病原體的診斷。中國的科學(xué)家能夠在SARS-CoV-2爆發(fā)后的較短時(shí)間內(nèi)，獲得病毒基因組全序列，也都是得益于測(cè)序技術(shù)。

通常，測(cè)序技術(shù)在疫情爆發(fā)中有三個(gè)作用：1、鑒定未知病原體，只有獲得病原全基因組才能確定新病原的身份；2、疫情發(fā)展階段可用于直接對(duì)臨床樣品開展檢測(cè)，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病毒基因組的突變情況以及輔助假陰性樣本確診；3、疫情常規(guī)檢測(cè)階段，可以用于耐藥位點(diǎn)篩選，也可以用于日常的呼吸道感染鑒別，提升呼吸道疾病的檢測(cè)準(zhǔn)確度。