[發明專利]用于雞傳喉疫苗株和野毒株的兩重PCR引物組及試劑盒

在審

• 申請號: 202010218895.1
• 申請日: 2020-03-25
• 公開（公告）號: CN111560468A
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 劉東;劉紅祥;李貴陽;曲心怡;李金積;王群義;李彬;王熊;沈巍
• 申請（專利權）人: 青島易邦生物工程有限公司;青島英賽特生物科技有限公司;青島迪諾瓦基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及一種用于雞傳喉疫苗株和野毒株的兩重PCR引物組及試劑盒，該引物組包含兩組引物對，分別是通用型上下游引物對和疫苗株上下游引物對；其中，通用型上下游引物對包括SEQ ID NO:1所示的通用型上游引物和SEQ ID NO:2所示的通用型下游引物，疫苗株上下游引物對包括SEQ ID NO:3所示的疫苗株上游引物和SEQ ID NO:4所示的疫苗株下游引物。利用本發明提供的試劑盒檢測雞傳喉疫苗株和野毒株準確性高、特異性強、靈敏度高、易于操作、快速且結果可靠。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及引物以及檢測試劑盒，具體涉及一種用 于雞傳喉疫苗株和野毒株的兩重PCR引物組及試劑盒。

背景技術

傳染性喉氣管炎(infectious laryngotracheitis,ILT)(以下簡稱雞傳喉)是由傳染性喉氣管類病毒引起雞的一種急性呼吸道傳染病，其特征為呼吸困難，咳 嗽，咳出含有血液的滲出物，喉部和氣管黏膜腫脹、出血并形成糜爛。本病傳 播速度快，病雞和帶毒雞是主要傳染源，污染的飼料、墊草和飲水是傳播媒介。 雞傳喉現已遍布各養禽國家和地區，我國有些地區呈地方流行性。本病常引起 死亡和產蛋下降，導致嚴重經濟損失，對養雞業造成巨大危害。

野毒感染和疫苗接種都可造成雞傳喉病毒的潛伏感染，帶毒雞能長時間間 歇性排毒而引起易感雞感染和發病，疫苗毒經6～10代傳代后毒力會返強。由于 本病保護性免疫主要依靠細胞介導免疫，滅活疫苗的免疫效果一般不理想，只 能使用活疫苗，接種活苗的雞可長時間排毒。因此，雞傳喉的凈化工作仍然未 取得明顯進展，主要原因在于沒有行之有效的檢測手段來區分野毒感染和疫苗 感染，常規的臨床診斷與病理變化診斷無法確診，血清學檢測周期過長且存在 結果不準的缺陷，最精準的檢測當屬利用分子生物學確定病原，淘汰陽性感染 包括病毒攜帶種雞。現有的分子檢測技術只能將雞傳喉與其他禽類疾病，并不 能區分疫苗感染和野毒感染，如果不能對疫苗株與野毒株很好的加以區分，那 么種雞場的凈化工作將成為空談。只有確定每只種雞確實是雞傳喉陰性或者只 有接種疫苗株的陽性，才能夠做到正確淘汰，實現凈化。

發明內容

本發明是提供了一種用于雞傳喉疫苗株和野毒株的兩重PCR引物組，通過 大量的數據分析，選定保守性強的基因作為目標擴增區段，利用Primer 5軟件 設計了2對引物，并將設計好的序列在NCBI上進行BLAST比對，確保種類的 保守性及種間的特異性。同時，本發明還提供了包含上述引物組配合使用的檢 測試劑盒，利用本發明提供的試劑盒檢測傳染性喉氣管炎疫苗株和野毒株株的 準確性高、特異性強、靈敏度高、易于操作、快速且結果可靠。

為了實現上述目標，本發明采用如下的技術方案：

一種用于雞傳喉疫苗株和野毒株的兩重PCR引物組，其特征在于，該引物 組包含兩組引物對，分別是通用型上下游引物對和疫苗株上下游引物對；其中， 通用型上下游引物對包括SEQ ID NO:1所示的通用型上游引物和SEQ ID NO:2所示 的通用型下游引物，疫苗株上下游引物對包括SEQ ID NO:3所示的疫苗株上游引 物和SEQ ID NO:4所示的疫苗株下游引物。

其中，優選方案如下：

所述通用型上游引物、通用型下游引物、疫苗株上游引物、疫苗株下游引 物的摩爾比為1：1：1：1。

本發明還提供了一種用于雞傳喉疫苗株和野毒株的兩重PCR試劑盒，其特 征在于，含有以下試劑：

A液：含有2xTaq PCR Mix的PCR反應液12.5uL、權利要求1所述的通用 型上游引物和通用型下游引物各1uL、權利要求1所述的疫苗株上游引物和疫苗 株下游引物各1uL、ddH₂O 3.5uL，其中各引物的濃度均為10uM；

B液：含有雞傳喉疫苗株和野毒株的目的基因的人工質粒各50uL，作為陽 性對照；