[發明專利]同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的特異性引物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010218818.6
• 申請日: 2020-03-25
• 公開（公告）號: CN111206110B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 呼高偉;付永前;鄭偉龍;吳佳怡;賈強
• 申請（專利權）人: 臺州學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/22;C12R1/01
• 代理公司: 杭州合信專利代理事務所(普通合伙) 33337
• 代理人: 黃平英

本申請公開一種同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的特異性引物組、試劑盒及方法，引物組包括：第一上游引物：5'?ATGAAAAAGAGTACTCTGGC?3'；第一下游引物：5'?TCAGAACTGGTAGGTCATGCC?3'；第二上游引物：5'?CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG?3'；第二下游引物：5'?CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC?3'。提取待測樣品的DNA，以所提取的DNA為模板、采用所述的特異性引物組進行雙重PCR，若擴增結果中同時在1053bp和1401bp處擴增出條帶，則判定待測樣品中含有肺炎克雷伯菌和金黃桿菌。本申請可同步PCR快速檢測方法，該方法具有操作簡單，快速，靈敏度高，操作簡單，結果明辨，易推廣。

技術領域

本申請屬于微生物檢測技術領域，具體涉及一種同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的特異性引物、試劑盒及方法。

背景技術

肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌屬(Klebsiella)，是分布廣泛且危害嚴重的條件性致病菌之一，主要存在于人和動物的腸道、呼吸道、泌尿生殖道。當宿主免疫力低下或長期服用抗生素導致機體菌群失調的情況下，該菌可“趁虛而入”引發一系列疾病，如肺炎、腦膜炎、肝膿腫、泌尿系統炎癥、傷口感染和全身敗血癥等。由于獸用抗生素的濫用導致該菌耐藥率的顯著上升，給該病的治療帶來了很大的挑戰。國內研究人員先后從牛、梅花鹿、水貂、豬以及水生生物鯉魚、對蝦和水禽等動物體內分離到該菌，說明該菌的感染宿主之多，流行范圍之廣，其發病后可增加宿主對其他病原的易感性，嚴重時引起死亡。肺炎克雷伯桿菌為革蘭氏陰性菌，呈單個或成雙的短桿狀，菌體兩極染色，無鞭毛，無芽孢，但有較厚的莢膜。

金黃桿菌屬(Chryseobacleriunz)是一個新近命名的菌屬，無鞭毛，無芽孢，嚴格好氧生長的一類菌革蘭氏陰性屬，呈短小桿狀。其廣泛分布于水體、土壤和環境中，是一種常見的條件性致病菌。金黃桿菌屬由原先的6個種和3個新種構成，包括腦膜炎敗血性金黃桿菌(C.meningosepticum)、產吲哚金黃桿菌(C.indologenes),黏金黃桿菌(C.gleum)、大比目魚金黃桿菌(C.balustinum)、大菱鲆金黃桿菌(C.scophthalmum)。金黃桿菌屬既可導致外源性感染，又能因宿主免疫力低下和抗生素濫用等引起內源性感染。金黃桿菌雖為條件性致病菌但其感染宿主范圍非常廣泛包括人，畜禽和水動物，其可引起新生兒腦膜炎、敗血癥及呼吸道感染等疾病的發生，并且先后從發病的牛、鱖魚、河蟹、鱘、烏鱧、中華鱉、鰻鱺體內分離到該致病菌。值得一提的是，金黃桿菌可引起棘胸蛙發生歪頭病，致死率達到100％，說明金黃桿菌對棘胸蛙具有較強的致病性，可造成極大的經濟損失。其可與多種條件性致病菌共存并造成混合感染，而且該菌對多種抗生素產生耐藥，因此針對該菌的準確診斷、流行病學調查和防控工作顯的十分重要。

作為“四大海產”之一的大黃魚，因其肉質鮮嫩，營養豐富深受消費者喜愛，是我國近海重要的經濟魚類。近年來，隨著集約化養殖程度的加快和人工養殖密度的增加，加上管理水平的參差不齊和漁藥的不規范使用，引起大黃魚抵抗力降低或者正常菌群的失調，導致易感染條件性致病菌肺炎克雷伯菌和金黃桿菌。病魚表現出行動遲緩、不合群、進食障礙、腹部脹氣、鰓絲潰爛，體表有出血性潰瘍斑、患魚抵抗力下降，從而增加對弧菌和刺激隱核蟲等病原的易感性，當前臨床多為混合感染病例，而且肺炎克雷伯菌和金黃桿菌為分布及其廣泛的條件性致病菌。

傳統的病原菌檢測方法是病原菌的形態學觀察和細菌的生理生化特征進行鑒定，存在耗時長和結果誤判的可能。通過擴增16SrRNA，尚需要借助測序結果才能判定。針對水產動物細菌病原的血清學方法，首先需要對具備優良免疫原性的候選蛋白進行篩選，表達和純化，免疫接種動物制備血清。該方法操作復雜，耗時長，成本高。熒光定量PCR需要對引物進行特殊的修飾，而且需要借助于昂貴的儀器來完成。

發明內容

本申請提供同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的特異性引物、試劑盒及方法，實現大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的同步快速檢測。