[發明專利]同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的特異性引物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010218818.6
• 申請日: 2020-03-25
• 公開（公告）號: CN111206110B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 呼高偉;付永前;鄭偉龍;吳佳怡;賈強
• 申請（專利權）人: 臺州學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/22;C12R1/01
• 代理公司: 杭州合信專利代理事務所(普通合伙) 33337
• 代理人: 黃平英

1.同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的特異性引物組，其特征在于，包括：

第一上游引物：5'-ATGAAAAAGAGTACTCTGGC-3'；

第一下游引物：5'-TCAGAACTGGTAGGTCATGCC-3'；

第二上游引物：5'-CGCGGATCCATGCAAGATTCAATAGCGGTG-3'；

第二下游引物：5'-CCGCTCGAGTTATTTAGCTTCGAAATAAAC-3'。

2.同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的試劑盒，其特征在于，包括如權利要求1所述的特異性引物組、10×Buffer、MgCl₂、dNTP?Mixture、Taq酶、滅菌的ddH₂O、陽性對照液和陰性對照液；

第一上游引物和第一下游引物的濃度均為10μM；第二上游引物和第二上游引物的濃度均為10μM。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的10×Buffer為2μL；所述的MgCl₂為1μL?25mM的MgCl₂；所述的dNTP?Mixture為1μL，dNTP?Mixture的濃度為10mM；所述Taq酶為1μL，Taq酶的酶活為5U/μL；所述的滅菌的ddH₂O為1mL。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照液為分別提取的肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的基因組DNA；陰性對照液為滅菌水。

5.非診斷目的的同步檢測大黃魚源肺炎克雷伯菌和金黃桿菌的方法，其特征在于，包括：提取待測樣品的DNA，以所提取的DNA為模板、采用如權利要求1所述的特異性引物組進行雙重PCR，若擴增結果中同時在1053bp和1401bp處擴增出條帶，則判定待測樣品中含有肺炎克雷伯菌和金黃桿菌；

所述雙重PCR的體系為：

10×Buffer?2μL，25mM?MgCl₂1μL，10mM?dNTP?Mixture1μL，10μM的兩組上、下游引物各0.5μL；Taq酶；1μL，Taq酶酶活為5U/μL；DNA模板1μL；滅菌水補齊至25μL；

所述雙重PCR的反應條件：95℃預變性3min，95℃變性15S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30個循環，72℃繼續延伸5min，溫度降至4℃，進行保存。