[發明專利]一種基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法

有效

• 申請號: 202010214433.2
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111471642B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 王丹丹;曹盛楠;師浩鈞;孫國棟;王從安;王平;張慶浩;侯廣建;王磊磊;張波;鄒亮;黃沁
• 申請（專利權）人: 山東省醫藥生物技術研究中心（山東省病毒研究所）
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發明屬于生物技術及細胞培養技術領域，具體涉及一種基于牽張力作用高效促進滑膜原代細胞增殖的方法。本發明所述高效促進滑膜細胞增殖的方法，通過在滑膜細胞培養過程中，以周期性機械應力對滑膜細胞進行加力培養的方式，可以在保持滑膜原代細胞原有特性的基礎上，能夠促進滑膜細胞增殖，顯著提高組織工程滑膜細胞的活性和生長狀態，有效提高了滑膜細胞的增殖性能，只需少量的滑膜組織即可高效培養滑膜細胞；且培養的滑膜細胞活性強，形態完整，更接近體內滑膜細胞的生物學特性，為最終提升組織工程骨關節的研究及樣本的高效利用提供了一條很好的途徑。

技術領域

本發明屬于生物技術及細胞培養技術領域，具體涉及一種基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法。

背景技術

滑膜(synovium)是關節囊的內層，呈淡紅色，薄而柔軟，由疏松結締組織組成。滑膜可以分泌滑液，在關節活動中起重要作用。滑膜組織是位于關節腔內面的內襯結構，各種關節內疾病都會累及滑膜，同時，近年研究發現，滑膜也參與了骨關節炎/類風濕性關節炎等疾病的整個病變過程。滑膜細胞的體外培養是研究其形態及功能的常用手段，通過體外培養滑膜細胞，并檢測其功能，在骨關節炎發病機制、臨床療效作用機制、抗風濕等新型藥物篩選及藥理機制方面具有重要意義，而體外培養滑膜細胞也是研究其形態、結構和功能，及其在關節病中的作用和影響的前提和基礎。

目前，滑膜細胞培養法有組織塊培養法和酶消化法等。組織塊培養法是在無菌的條件下取出滑膜組織，用無菌的PBS溶液沖洗3遍，然后用眼科剪分離滑膜周圍的脂肪組織并將滑膜剪碎成1-2mm³的碎塊，將碎塊在細胞培養瓶底部均勻鋪展，加入2ml DMEM完全培養液，置于37℃、5％CO₂的培養箱中培養，每3-5d更換培養基并小心除去非貼壁組織塊，當成纖維樣滑膜細胞鋪滿70％-80％的瓶底時傳代。酶消化法是在超凈臺內取出滑膜組織，用無菌PBS溶液沖洗3遍，分離滑膜組織，然后將滑膜組織充分剪碎后放入培養瓶中，用0.25％胰蛋白酶消化30min，離心棄胰酶，再加入膠原酶消化2h，最后過濾加入2ml DMEM完全培養液，置于37℃、5％CO₂的培養箱中培養，每24h換液1次，細胞長滿瓶底時進行傳代。

但是，在臨床應用中，組織塊培養法通過體外分離培養獲得的滑膜細胞生長周期長，細胞傳代次數少，不利于OA的研究；酶消化法缺點是酶濃度過高或者酶消化時間過長都會對細胞造成損傷，降低細胞傳代活性，而且由于酶消化時間過短，組織塊消化不充分，消化分離的細胞比較少，此外，細胞過篩網時組織塊容易堵塞篩孔而導致濾過的細胞量比較少，且細胞容易被污染。因此，如何在分離的滑膜細胞基礎上促進滑膜原代細胞的增殖性能一直是本領域的研究熱點和難點。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，該方法在保持滑膜原代細胞原有特性的基礎上，能有效地增強滑膜細胞增殖能力，提高滑膜細胞活性及生長狀態，為最終提升組織工程骨關節的研究及樣本的高效利用提供了一條很好的途徑。

為解決上述技術問題，本發明所述的一種基于牽張力作用高效促進滑膜原代細胞增殖的方法，包括如下步驟：

(1)取分離的滑膜原代細胞進行傳代處理，得到第二代滑膜細胞，備用；

(2)將得到的第二代滑膜細胞加胰蛋白酶液進行消化，消化結束后離心棄上清；收集沉淀物并加入含FBS的DMEM培養液重懸，形成細胞懸液，用計數板計數；

(3)將所述細胞懸液鋪于細胞力學加載儀的加力硅膠板中，每孔加入含FBS的DMEM培養液，并將鋪好板的細胞力學加載儀置于CO₂培養箱中進行培養；

(4)培養結束后，取出細胞力學加載儀，并將所述加力硅膠板中的培養液吸出，另加入含FBS的DMEM培養液；將所述細胞力學加載儀的控制箱連接電腦，讀取設備，設置力學控制參數并寫入設備，將其與加力硅膠板連接并通電后，放入CO₂培養箱中進行培養，即得。