[發明專利]一種基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法

有效

• 申請號: 202010214433.2
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111471642B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 王丹丹;曹盛楠;師浩鈞;孫國棟;王從安;王平;張慶浩;侯廣建;王磊磊;張波;鄒亮;黃沁
• 申請（專利權）人: 山東省醫藥生物技術研究中心（山東省病毒研究所）
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取分離的滑膜原代細胞進行傳代處理，得到第二代滑膜細胞，備用；

所述滑膜原代細胞按照如下步驟進行分離：

(a)取人體新鮮滑膜組織置于無菌培養皿中，采用Hank′s平衡鹽混合液反復沖洗，并將清洗后的滑膜組織轉移至無菌培養瓶中，以無菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡鹽混合液混勻，離心并棄上清；

(b)收集離心后的沉淀物，加入含有青鏈霉素混合液的DMEM培養液重懸，并加入含Ⅱ型膠原酶和糖苷酶的消化液，置于CO₂培養箱中進行消化培養；

(c)培養結束后，取出培養物并加入胰蛋白酶，吹打成漿狀，隨后用無菌細胞過濾篩過濾，收集濾液并離心，棄上清；

(d)收集離心后的沉淀物，用DMEM高糖培養液重懸沉淀物，置于細胞培養瓶于CO₂細胞培養箱中，進行細胞培養，待細胞貼壁，即得所需人滑膜原代細胞；

(2)將得到的第二代滑膜細胞加胰蛋白酶液進行消化，消化結束后離心棄上清；收集沉淀物并加入含FBS的DMEM培養液重懸，形成細胞懸液，用計數板計數；

(3)將所述細胞懸液鋪于細胞力學加載儀的加力硅膠板中，每孔加入含FBS的DMEM培養液，并將鋪好板的細胞力學加載儀置于CO₂培養箱中進行培養；

(4)培養結束后，取出細胞力學加載儀，并將所述加力硅膠板中的培養液吸出，另加入含FBS的DMEM培養液；將所述細胞力學加載儀的控制箱連接電腦，讀取設備，設置力學控制參數并寫入設備，所述力學控制參數包括：5-8％拉伸幅度，0.4-0.6Hz，21000-22000個循環周期，將其與加力硅膠板連接并通電后，放入CO₂培養箱中進行培養，即得。

2.根據權利要求1所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述胰蛋白酶液中胰蛋白酶的質量含量為0.2-0.3wt％。

3.根據權利要求2所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述DMEM培養液中FBS的質量含量為9-12wt％。

4.根據權利要求3所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，控制所述加力硅膠板中，每孔含2×10⁵個細胞。

5.根據權利要求4所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述DMEM培養液中FBS的質量含量為9-12wt％。

6.根據權利要求5所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述培養步驟為35-40℃、3-8％CO₂培養箱中進行培養20-30h。

7.根據權利要求1-6任一項所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述DMEM培養液中FBS的質量含量為4-6wt％。

8.根據權利要求7所述基于牽張力作用高效促進滑膜細胞增殖的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述培養步驟為35-40℃、3-8％CO₂培養箱中進行培養20-30h。