[發(fā)明專利]一種高效分離人滑膜原代細(xì)胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010214431.3
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111411076B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王丹丹;曹盛楠;師浩鈞;劉凡杰;孫國棟;王平;王磊磊;李華忠;陳元振;侯廣建;王濤;孟巖;任鵬程
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心（山東省病毒研究所）
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發(fā)明屬于生物技術(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效分離人滑膜原代細(xì)胞的方法。本發(fā)明所述高效分離人滑膜原代細(xì)胞的方法，采用Hank′s平衡鹽溶液對滑膜進行預(yù)處理，并在加入Ⅱ型膠原酶和糖苷酶消化處理后于CO₂培養(yǎng)箱中進行消化培養(yǎng)，隨后再次加入胰蛋白酶進行處理；經(jīng)兩次酶消化后的細(xì)胞經(jīng)DMEM高糖培養(yǎng)液重懸后再次進行CO₂培養(yǎng)，可高效分離人滑膜組織中的滑膜細(xì)胞，并大大縮短組織塊貼壁時間，獲得純度高、數(shù)量足的滑膜細(xì)胞，且獲得的滑膜細(xì)胞活性強，形態(tài)完整，更接近體內(nèi)滑膜細(xì)胞的生物學(xué)特性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效分離人滑膜原代細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

滑膜(synovium)是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，呈淡紅色，薄而柔軟，由疏松結(jié)締組織組成。滑膜可以分泌滑液，在關(guān)節(jié)活動中起重要作用。正常的滑膜分為兩層，即薄的細(xì)胞層(內(nèi)腔層)和血管層(內(nèi)膜下層)。滑膜細(xì)胞起源于骨骼胚基中的間充質(zhì)。滑膜組織內(nèi)包含多種細(xì)胞，如滑膜細(xì)胞、白細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。滑膜細(xì)胞又分A型和B型兩種。巨噬細(xì)胞樣A型細(xì)胞(MLC)有絲狀偽足，具有吞噬功能，不具有增殖能力。B型滑膜細(xì)胞(FLC)又稱成纖維滑膜細(xì)胞，分裂增殖迅速，可以進行體外傳代培養(yǎng)。

由于滑膜細(xì)胞可以分泌多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1(IL-1)等介質(zhì)參與關(guān)節(jié)損傷的病理過程。滑膜細(xì)胞是維持關(guān)節(jié)正常功能的重要組織結(jié)構(gòu)，同時也是各種關(guān)節(jié)疾病疾患時的主要病變部位，特別是內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中滑膜組織的改變最為明顯。通過體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，并檢測其功能，在研究骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制、臨床療效作用機制、抗風(fēng)濕等新型藥物篩選及藥理機制方面具有重要意義，而體外培養(yǎng)滑膜細(xì)胞也是研究其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，及其在關(guān)節(jié)病中的作用和影響的前提和基礎(chǔ)。而如何最大限度的將滑膜原代細(xì)胞從滑膜組織中進行分離，同時保持細(xì)胞的完整性和代謝活性，是亟需解決的一個難題。

目前，滑膜細(xì)胞培養(yǎng)法有組織塊培養(yǎng)法、酶消化法等。組織塊培養(yǎng)法是在無菌的條件下取出滑膜組織，用無菌的PBS溶液沖洗3遍，然后用眼科剪分離滑膜周圍的脂肪組織并將滑膜剪碎成1-2mm³的碎塊，將碎塊在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部均勻鋪展，加入2ml DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-5d更換培養(yǎng)基并小心除去非貼壁組織塊，當(dāng)成纖維樣滑膜細(xì)胞鋪滿70％-80％的瓶底時傳代。酶消化法是在超凈臺內(nèi)取出滑膜組織，用無菌PBS溶液沖洗3遍，分離滑膜組織，然后將滑膜組織充分剪碎后放入培養(yǎng)瓶中，用0.25％胰蛋白酶消化30min，離心棄胰酶，再加入膠原酶消化2h，最后過濾加入2ml DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h換液1次，細(xì)胞長滿瓶底時進行傳代。在臨床應(yīng)用中，組織塊培養(yǎng)法的缺點是組織塊種植困難不易成活、且原代細(xì)胞生長周期長、細(xì)胞數(shù)量少；酶消化法的缺點是不能有效消化分離纖維組織，使滑膜細(xì)胞不易游離，且過篩網(wǎng)時堵塞網(wǎng)孔，故細(xì)胞數(shù)量很少。

可見，開發(fā)一種可獲得純度高數(shù)量足的滑膜細(xì)胞的高效分離滑膜細(xì)胞的方法具有積極的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高效、穩(wěn)定、便捷分離人滑膜原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法，該方法可簡化傳統(tǒng)原代培養(yǎng)方法，降低成本，得到大量的滑膜細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的一種高效分離人滑膜原代細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

(1)取人體新鮮滑膜組織置于無菌培養(yǎng)皿中，采用Hank′s平衡鹽混合液反復(fù)沖洗，并將清洗后的滑膜組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶中，以無菌剪刀剪碎，移入EP管并加入Hank′s平衡鹽混合液混勻，離心并棄上清；

(2)收集離心后的沉淀物，加入含有青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液重懸，并加入含Ⅱ型膠原酶和糖苷酶的消化液，置于CO₂培養(yǎng)箱中進行消化培養(yǎng)；