[發明專利]一種重組A型口蹄疫病毒VP1基因的塞內卡重組病毒、重組疫苗株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010212907.X
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111996201B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 鄭海學;楊帆;曹偉軍;蔣保余;朱紫祥;魏婷;鄭敏;田宏;張克山;張偉;劉永杰;黨文;馬旭升;李丹;茹毅;何繼軍;郭建宏;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/42;C12N7/01;C12N15/85;A61K39/125;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

1.一種塞內卡病毒重組核酸，其特征在于，所述重組核酸的序列包括對塞內卡病毒株的5'UTR基因序列進行缺失突變改造，同時在塞內卡病毒cDNA的SphⅠ和NotⅠ酶切位點之間插入A型口蹄疫病毒的VP1基因；

對塞內卡病毒株的5'UTR基因序列進行缺失突變改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；插入的A型口蹄疫病毒的VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的重組核酸，其特征在于，所述塞內卡病毒株選自SVV/FJ/001株，所述SVV/FJ/001株的保藏編號為CCTCC NO.V201802。

3.權利要求1或2所述重組核酸在制備重組A型FMDVVP1基因的塞內卡病毒重組核酸或塞內卡重組疫苗株中的應用。

4.一種包含權利要求1或2所述的重組核酸的重組A型FMDVVP1基因的塞內卡重組病毒。

5.一種由權利要求1或2所述的重組核酸編碼的重組A型FMDVVP1基因的塞內卡重組病毒。

6.一種包含權利要求4或5所述的塞內卡重組病毒的塞內卡重組疫苗株。

7.權利要求4或5所述的塞內卡重組病毒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以A/GDMM/2013株的cDNA為模板，用特異性引物對擴增得到A型FMDV的VP1基因；擴增所述VP1基因的特異性引物對包括上游引物和下游引物AS-R，所述上游引物包括AVP1-F0和AVP1-F，所述上游引物AVP1-F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述上游引物AVP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物AS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)以SVV/FJ/001株的cDNA為模板，利用特異性引物對分別擴增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S20片段；擴增所述S1片段的特異性引物對包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述SVV/FJ/001株的保藏編號為CCTCC NO.V201802；

擴增所述S20片段的特異性引物對包括上游引物SVA-2F1和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；

(3)將步驟(1)得到的VP1基因片段與所述S20基因片段融合，得S2-AVP1片段；

(4)將所述S1片段和S2-AVP1片段分別與pMD20T載體連接，得到亞克隆質粒PMD-S1和PMD-S2-AVP1；

(5)以所述亞克隆質粒PMD-S1為模板，用突變引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR進行擴增，得到亞克隆質粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(6)將質粒PMD-mS1用PacI和SphI雙酶切、質粒PMD-S2-AVP1用SphI和NotI雙酶切后，回收基因片段，連接替換插入到經PacI和NotI雙酶切后的真核轉錄質粒prO/CHA/99中，得到重組質粒prSVV/FJ-M-AVP1；

(7)將得到的所述重組質粒prSVV/FJ-M-AVP1轉染塞內卡病毒敏感細胞，獲得重組A型FMDVVP1基因的塞內卡重組病毒。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(3)中利用引物AVP1-F和SVA-2R進行融合PCR，使基因片段融合；所述AVP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。