[發明專利]基于單質粒拯救系統的塞內卡病毒感染性克隆及構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010212435.8
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111394389A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 鄭海學;楊帆;朱紫祥;曹偉軍;田宏;張克山;魏婷;張偉;鄭敏;黨文;馬旭升;李丹;茹毅;何繼軍;郭建宏;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

本發明提供了一種針對正鏈RNA病毒的單質粒拯救系統及基于該系統的塞內卡病毒感染性克隆及構建方法和應用，涉及基因工程技術領域。本發明提供了針對正鏈RNA病毒的單質粒拯救系統以及利用該拯救系統可定向設計SVA反向重組疫苗及構建SVA定向突變毒株在病毒基因功能、病毒變異及致病機制等研究中的應用。本發明利用聚合酶I和聚合酶II啟動子、終止子、核酶等元件構建的單質粒塞內卡病毒拯救系統，實現了在質粒水平上編輯病毒基因組，為病毒定向設計、構建和拯救提供了技術平臺。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及基于單質粒拯救系統的塞內卡病毒感染性克隆及構建方法和應用。

背景技術

塞內卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也稱塞內卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞內卡病毒屬(Senecavirus)，也是該屬的唯一成員。該病毒感染豬能夠引起豬的原發性水泡病，與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎等引起的臨床癥狀難以區分。SVA感染后能引起斷奶仔豬、保育、育肥和繁殖的各年齡段的豬發生水泡性病變，同時伴隨跛行、發熱、厭食、嗜睡等臨床癥狀，新生仔豬除了上述癥狀外，還可能存在持續的腹瀉、脫水等癥狀，甚至會突然死亡。

塞內卡病毒先后在美國、加拿大、巴西、哥倫比亞、中國、泰國等多個國家引發疫情，2015年傳入我國，首次在廣東出現疫情，并迅速擴散，在福建、廣西、湖北、河南、河北、山東、遼寧等省均引起大量豬場發病，傳播速度和致病力均比此前報道的有所增強，且有研究表明目前我國SVA流行毒株復雜，防控形勢依然嚴峻。由于塞內卡病毒引起的臨床發病癥狀與口蹄疫相似，且能與其形成混合感染，對口蹄疫的防控形成嚴重干擾，因此急需一個技術平臺開展塞內卡病毒基礎理論研究和防控產品創制。利用反向遺傳操作技術平臺建立SVA感染性克隆，研究塞內卡病毒變異、致病機制及高效疫苗研制等工作，顯得尤為重要和迫切。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種針對正鏈RNA病毒的單質粒高效拯救系統，包括用所述單質粒拯救系統構建SVA感染性克隆的方法，以及利用該拯救系統定向構建、拯救SVA用于病毒基因功能、病毒變異及致病機制等基礎研究和定向設計制備反向重組疫苗的應用研究。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種針對正鏈RNA病毒的單質粒拯救系統，所述單質粒拯救系統為包含有正鏈RNA病毒核酸序列的真核轉錄質粒，所述真核轉錄質粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨細胞病毒RNA聚合酶II啟動子、鼠源RNA聚合酶I啟動子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶終止子I和聚合酶終止子II序列；

所述正鏈RNA病毒包括塞內卡病毒。

優選的，所述真核轉錄質粒的骨架載體包括pcDNA3.1。

優選的，當所述正鏈RNA病毒為塞內卡病毒時，將所述塞內卡病毒的核苷酸序列插入pcDNA3.1的PacI和NotI酶切位點之間。

優選的，所述插入的塞內卡病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本發明提供了一種塞內卡病毒全長感染性克隆的構建方法，包括以下步驟：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA為模板，用特異性引物對擴增SVV/FJ/001株的A基因；所述特異性引物對包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；