[發明專利]基于單質粒拯救系統的塞內卡病毒感染性克隆及構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010212435.8
• 申請日: 2020-03-24
• 公開（公告）號: CN111394389A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 鄭海學;楊帆;朱紫祥;曹偉軍;田宏;張克山;魏婷;張偉;鄭敏;黨文;馬旭升;李丹;茹毅;何繼軍;郭建宏;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/66;C12N7/01;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 朱玲艷

1.一種針對正鏈RNA病毒的單質粒拯救系統，其特征在于，所述單質粒拯救系統為包含有正鏈RNA病毒核酸序列的真核轉錄質粒，所述真核轉錄質粒在病毒核酸序列的5'端上游含人巨細胞病毒RNA聚合酶II啟動子、鼠源RNA聚合酶I啟動子和核酶序列；在病毒核酸序列的3'端下游含核酶、鼠源聚合酶終止子I和聚合酶終止子II序列；

所述正鏈RNA病毒包括塞內卡病毒。

2.一種塞內卡病毒全長感染性克隆的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA為模板，用特異性引物對擴增SVV/FJ/001株的A基因；所述特異性引物對包括上游引物和下游引物SVA-AR；所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F，所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物SVA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)以SVV/FJ/001株的cDNA為模板，用特異性引物對擴增SVV/FJ/001株的B基因，所述特異性引物對包括上游引物SVA-BF和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)將步驟(1)和步驟(2)擴增得到的A基因和B基因分別與pMD20T載體連接，轉化JM109感受態細胞，得質粒PMD-A和PMD-B；

(4)將質粒PMD-A用PacI和NheI雙酶切、質粒PMD-B用NheI和NotI雙酶切后，回收目的片段，連接替換插入到經PacI和NotI雙酶切后的權利要求1或2所述真核質粒中，轉化至JM109感受態細胞中，得真核轉錄質粒prSVV/FJ；

步驟(1)和步驟(2)不存在時間上的限制關系。

3.利用權利要求2所述構建方法構建得到的塞內卡病毒全長感染性克隆在拯救塞內卡病毒中的應用。

4.一種拯救塞內卡病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：將真核轉錄質粒prSVV/FJ轉染塞內卡病毒敏感細胞，置于含5％CO₂的37℃培養箱中培養，當80％～90％的細胞出現病變時收獲病毒，反復凍融3次后再次接種塞內卡病毒敏感細胞，直到病毒能穩定地產生細胞病變，得重組病毒rSVV/FJ。

5.一種塞內卡重組病毒rSVV/FJ，其特征在于，所述塞內卡重組病毒rSVV/FJ能在BHK-21細胞、PK-15細胞、ST細胞、SK-RST細胞、IBRS-2細胞、H1299細胞或293T細胞中增殖，并引起細胞病變。

6.如權利要求5所述的塞內卡重組病毒rSVV/FJ，其特征在于，所述塞內卡重組病毒rSVV/FJ的基因中含沉默突變的NheI分子標記，該遺傳標記可與親本野生型毒株相鑒別。

7.利用權利要求4所述的方法獲得的塞內卡重組病毒或權利要求5或6所述的重組病毒在制備SVA重組疫苗中的應用。

8.利用權利要求1所述的單質粒拯救系統在構建SVA定向突變毒株中的應用。

9.利用權利要求1所述的單質粒拯救系統在定向設計SVA反向重組疫苗中的應用。