[發明專利]一種開啟型雙光子核酸探針及其在FISH中的應用

有效

• 申請號: 202010202893.3
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN112410404B
• 公開（公告）日: 2023-05-19
• 發明（設計）人: 饒軍;國立浩;鈄方芳;鄭智
• 申請（專利權）人: 江西省腫瘤醫院(江西省癌癥中心)
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11;C09B23/14
• 代理公司: 深圳泛航知識產權代理事務所(普通合伙) 44867
• 代理人: 鄧愛軍

本發明公開了一種開啟型雙光子核酸探針及其在FISH中的應用，選取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2懸浮于20ml的1，2?二氯苯中，得混合物，該混合物在100?120℃下攪拌反應14?16h，待反應溶液冷卻至20?25℃，向反應混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得懸浮物，本發明涉及核酸探針技術領域。該開啟型雙光子核酸探針及其在FISH中的應用，具備不錯的激發波長通透性和熒光信號控制性能，同時還具有顯色性強、光穩定性好等特點，實現了深層組織或器官中DNA的特異性雙光子成像，與此同時，它還可以在不改變染料核心共軛結構的前提下對該熒光核酸探針進行改造，從而可以進一步開發為相應的生理、病理學研究用生物檢測探針。

技術領域

本發明涉及核酸探針技術領域，具體為一種開啟型雙光子核酸探針及其在FISH中的應用。

背景技術

DNA的空間結構即DNA與蛋白質或RNA之間的動態相互作用調節著遺傳功能的輸出，例如，基因組的亞核定位可以調節基因表達、異染色質形成和DNA復制。因此，探索細胞內DNA的時空調控，對于理解多種生理環境下的動態變化，驗證核酸分布與生理性能之間的關系具有重要意義。通常，通過熒光原位雜交研究特定亞細胞區域中感興趣的DNA的定位。盡管這些技術看起來簡單有效，但它們需要標本固定，而且只適用于原位可視化。為了在活細胞中顯示特定的基因組位點經常應用熒光標記的DNA結合蛋白。不幸的是，當未結合熒光團或FP自由擴散時，存在顯著的熒光背景，并且可能影響DNA的定位、穩定性和行為方式。為了更高的信噪比，需要每個目標有數十個基序重復。盡管有這些局限性，這些系統已經被廣泛認可并應用于細胞成像。為了降低信號背景并提供更多的生命信息，人們設計了許多成像方法，如分子信標、GFP重組和猝滅自連接等。這些方法由于具有觀察內源核酸的自然生理環境而具有極大的優越性。然而，這些方法都沒有應用于研究體內或組織中的核酸動力學。針對現有方法存在的可用性低、序列設計限制、反應性或構象變化響應慢、背景熒光強度高或熒光可逆性低等問題，出現了一種新型熒光可控探針，被稱為激子控制雜交敏感的熒光寡核苷酸探針。盡管有這些優點，但由于可見光的滲透性有限，該探針僅適用于薄組織切片的成像，不滿足監測深層組織或器官中的基因組信息。

雙光子激發熒光顯微鏡(TPM)與傳統的單光子激發技術相比，具有光損傷小、光漂白少、檢測靈敏度高的優點。在TP中，較長波長的激發光也可以減少細胞損傷。這項技術還可以減少離焦輻射。盡管雙光子技術在組織器官成像中有上面的優勢，目前的熒光探針并不能特異性地展示器官中的靶核酸。因此，在組織器官中靶核酸成像檢測方面，依然缺乏優良的核酸探針。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種開啟型雙光子核酸探針及其在FISH中的應用，解決了現有的熒光探針不能特異性地展示器官中靶核酸的問題。

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：一種開啟型雙光子核酸探針，其制備方法具體包括以下步驟：

S1、含苯乙基青色素的制備：

a1、選取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2懸浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，該混合物在100-120℃下攪拌反應14-16h，待反應溶液冷卻至20-25℃，向反應混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得懸浮物，合成的懸浮液在20-25℃下停留2-2.2h，產生的沉淀經過過濾，用二氯甲烷洗滌，減壓干燥，得到白色粉末狀化合物3，其反應式如(1)所示：

a2、選取a1中制備的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4懸浮于30ml的乙酸酐中，得懸浮液，所得懸浮液在100-120℃下攪拌反應30-35min，將10ml蒸餾水緩慢加入反應混合物中，再在100-120℃下攪拌26-30min，溶劑蒸發后，在殘渣中加入丙酮100ml，沉淀經過過濾，用丙酮洗滌，減壓干燥得到紫色粉末狀化合物D，其反應式如(2)所示：