[發明專利]一種開啟型雙光子核酸探針及其在FISH中的應用

有效

• 申請號: 202010202893.3
• 申請日: 2020-05-27
• 公開（公告）號: CN112410404B
• 公開（公告）日: 2023-05-19
• 發明（設計）人: 饒軍;國立浩;鈄方芳;鄭智
• 申請（專利權）人: 江西省腫瘤醫院(江西省癌癥中心)
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11;C09B23/14
• 代理公司: 深圳泛航知識產權代理事務所(普通合伙) 44867
• 代理人: 鄧愛軍

1.一種開啟型雙光子核酸探針，其特征在于：其制備方法具體包括以下步驟：

S1、含苯乙基青色素的制備：

a1、選取8.0ml即50.0mmol的化合物1和18.1g即100mmol的化合物2懸浮于20ml的1，2-二氯苯中，得混合物，該混合物在100-120℃下攪拌反應14-16h，待反應溶液冷卻至20-25℃，向反應混合物中加入了300ml的二氯甲烷，得懸浮物，合成的懸浮液在20-25℃下停留2-2.2h，產生的沉淀經過過濾，用二氯甲烷洗滌，減壓干燥，得到白色粉末狀化合物3，其反應式如(1)所示：

a2、選取a1中制備的1020mg即3.00mmol的化合物3和521mg即3.50mmol的化合物4懸浮于30ml的乙酸酐中，得懸浮液，所得懸浮液在100-120℃下攪拌反應30-35min，將10ml蒸餾水緩慢加入反應混合物中，再在100-120℃下攪拌26-30min，溶劑蒸發后，在殘渣中加入丙酮100ml，沉淀經過過濾，用丙酮洗滌，減壓干燥得到紫色粉末狀化合物D，其反應式如(2)所示：

S2、可雙光子激發的雜交敏感熒光核酸探針的制備：

b1、選取4.6mg即40μmole的N-羥基琥珀酰亞胺和7.7mg即40μmole的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽添加到a2中制備的20μmole的合成染料D的DMF溶液中，20-25℃攪拌14-16h，反應混合物與DNA寡聚物被用于下一個反應沒有進一步凈化；

b2、采用DNA/RNA合成儀和用傳統的磷酰胺法合成DNA寡聚物，用商業上可用的dA、dG、dC、dT和二氨基修飾核苷dU對應的磷酰胺進行偶聯合成核酸探針，合成的DNA用28％的氨水于50-55℃下裂解4.6-5h，利用真空離心法除去反應混合物中的氨水后用HPLC純化相應的核酸產物，柱子為5-ODA-H反向柱，洗脫緩沖液為0.1M的pH7.0TEAA緩沖液，洗脫梯度為持續26-30min，5％-40％的現性梯度，流速為3ml/min；

b3、將染料D的琥珀酰亞胺酯的DMF溶液和溶有活性氨基核酸的pH值為9的碳酸鈉緩沖液混合并于23-25℃條件下反應1.5-1.7h，將反應混合物溶于乙醇，于-20℃條件下高速離心18-20min，然后除去上清，將殘余固體溶于少量水，然后用0.45um的濾膜過濾，用HPLC純化相應的核酸偶聯產物，產物即為所述開啟型雙光子核酸探針，HPLC純化所用柱子為5-ODA-H反向柱，洗脫緩沖液為0.1M的pH7.0?TEAA緩沖液，洗脫梯度為持續27-30min，5％-40％的現性梯度，流速為3ml/min。

2.根據權利要求1所述的一種開啟型雙光子核酸探針，其特征在于：b3中，所述開啟型雙光子核酸探針的濃度用紫外分光光度計測量，熒光核酸探針分子量用MALDI-TOF質譜儀進行表征。

3.權利要求1所述的一種開啟型雙光子核酸探針在核酸原位檢測中的應用。