[發明專利]一種利用甘油制備4-乙基苯酚的方法

有效

• 申請號: 202010199444.8
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111269948B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 丁少軍;張瑩
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12N15/60;C12N15/53;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開一種利用甘油制備4?乙基苯酚方法，屬于生物工程技術領域。該方法在大腸桿菌中構建了4?乙基苯酚的生物合成途徑：以甘油為底物，在大腸桿菌中通過糖酵解途徑和莽草酸途徑合成酪氨酸，然后在酪氨酸氨解酶催化作用下，酪氨酸被轉化為對香豆酸，隨后，對香豆酸在酚酸脫羧酶的催化下生成4?乙烯基苯酚。最后，在苯酚還原酶的催化下，4?乙烯基苯酚被轉化為4?乙基苯酚。本發明提供了一個新的4?乙基苯酚生產途徑，該方法具有生產成本低，生產能耗低，環境污染小等優點，也為將來的大規模工業應用奠定了基礎，具有重要的經濟價值和社會效益。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及利用甘油制備4-乙基苯酚的方法。

背景技術

由于化石燃料資源的枯竭以及對傳統石化工業可持續發展的關注，生物可再生燃料和化學制品受到越來越多的關注。隨著代謝工程的發展和新代謝途徑的發現，以前難以從大自然中獲得的化合物可以通過微生物的生物合成而獲得。生物合成法與傳統的化學合成法相比，具有反應條件溫和，底物親和性好，以及不影響環境等優點，且生物法合成的產物可以看作是天然產物，可直接用于食品與醫藥行業。近年來，不少研究者們在微生物中(如大腸桿菌，釀酒酵母等)建立了人工生物合成途徑，以葡萄糖或甘油作為可再生底物，來獲取高價值的芳香族化合物及其衍生物，例如肉桂酸，對香豆酸，咖啡酸，阿魏酸，香蘭素、4-乙烯基苯酚、苯乙烯等。

4-乙基苯酚，英文名4-Ethylphenol，分子式C₈H₁₀O，分子量122.16，CAS號：123-07-9。4-乙基苯酚是芳香族化合物的衍生物，為無色或白色結晶，可因光照而變黃，具有強烈木酚氣味，廣泛用作食品香料，酚醛樹脂，抗氧化劑等。4-乙基苯酚還是重要的有機合成中間體和化學藥品試劑，可以通過熱解催化從生物質中提取。當前4-乙基苯酚的工業生產僅依賴于石化工業，主要包括三個步驟，即乙苯磺化以生產乙苯磺酸混合物，分離對乙苯磺酸和最后用堿融合以獲得4-乙基苯酚，但是該過程復雜且對環境不利。因此，生物技術方法將是可持續生產4-乙基苯酚的替代方法，但是目前還沒有發現微生物從簡單碳源生物合成4-乙基苯酚然的代謝途徑。申請人基于我們大量的前期研究，基于合成生物學原理，在大腸桿菌中人工構建了由三種酶---酪氨酸氨解酶、酚酸脫羧酶和苯酚還原酶組成的4-乙基苯酚的人工生物合成途徑：以甘油為底物，在大腸桿菌中通過糖酵解途徑和莽草酸途徑合成酪氨酸，然后在酪氨酸氨解酶催化作用下，酪氨酸被轉化為對香豆酸，隨后，對香豆酸在酚酸脫羧酶的催化下生成4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚在苯酚還原酶作用下生成4-乙基苯酚。

發明內容

針對傳統化學合成4-乙基苯酚過程中成本高，能耗高，環境污染重等不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，以甘油為底物，通過在大腸桿菌中構建4-乙基苯酚的人工合成途徑，實現從甘油到4-乙基苯酚的生產；該方法具有條件溫和，生產成本低，環境污染小等優點。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，先在微生物中構建出4-乙基苯酚的合成途徑，然后以甘油為底物進行微生物發酵，制備出4-乙基苯酚；所述的合成途徑為：以甘油為底物，通過糖酵解途徑和莽草酸途徑合成酪氨酸，然后酪氨酸在酪氨酸解氨酶作用下生成對香豆酸，對香豆酸在酚酸脫羧酶作用下生成4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚在苯酚還原酶作用下生成4-乙基苯酚。

所述的微生物為大腸桿菌。

所述的合成途徑包括三個基因的異源表達，包括來自Saccharothrixespanaensis的酪氨酸解氨酶基因setal、來自Bacillus atrophaeu的酚酸脫羧酶基因bapad和來自Lactobacillusplantarum的苯酚還原酶基因。

所述的三個基因的異源表達為將三個基因克隆到同一表達載體pETDuet-1中，得到重組質粒pETDuet-tal-pad-vpr。

發酵溫度為37℃。