[發明專利]一種利用甘油制備4-乙基苯酚的方法

有效

• 申請號: 202010199444.8
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111269948B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 丁少軍;張瑩
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12N15/60;C12N15/53;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，先在微生物中構建出4-乙基苯酚的合成途徑，然后以甘油為底物進行微生物發酵，制備出4-乙基苯酚；所述的合成途徑為：以甘油為底物，通過糖酵解途徑和莽草酸途徑合成酪氨酸，然后酪氨酸在酪氨酸解氨酶作用下生成對香豆酸，對香豆酸在酚酸脫羧酶作用下生成4-乙烯基苯酚，4-乙烯基苯酚在苯酚還原酶作用下生成4-乙基苯酚；所述的微生物為大腸桿菌；所述的合成途徑包括三個基因的異源表達，包括來自Saccharothrix espanaensis的酪氨酸解氨酶基因setal、來自Bacillus atrophaeu的酚酸脫羧酶基因bapad和來自Lactobacillusplantarum的苯酚還原酶基因。

2.根據權利要求1所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，所述的三個基因的異源表達為將三個基因克隆到同一表達載體pETDuet-1中，得到重組質粒pETDuet-tal-pad-vpr。

3.根據權利要求1所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，發酵溫度為37℃。

4.根據權利要求1所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)將編碼酪氨酸解氨酶的基因tal，編碼酚酸脫羧酶的基因pad和編碼苯酚還原酶的基因vpr，克隆到大腸桿菌表達載體pETDuet-1中，構建重組質粒pETDuet-tal-pad-vpr；

(2)將重組質粒pETDuet-tal-pad-vpr分別轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)和E.coliTransB(DE3)，得到重組菌E.coli BL21-TPV和E.coli TransB-TPV；

(3)將重組菌在LB培養基中37℃培養過夜，之后按2％的接種量接入100mL TB培養基，向培養基中添加或不添加滲透劑，37℃培養至OD600為0.8時加入終濃度為0.2mM的IPTG，在20～37℃培養72h；每隔12h取樣測產物4-乙基苯酚的濃度。

5.根據權利要求4所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步驟(1)中，主要構建步驟如下：

1)以pET21b-setal為模板，以setal-F和setal-R為引物，對setal的序列進行PCR擴增；將setal-PCR片段克隆到載體pETDuet-1中，酶切位點為SacI和NotI，生成pETDuet-setal；

2)以pET28a-bapad作為模板并以bapad-F和bapad-R作為引物對bapad的序列進行PCR擴增；用NdeI和XhoI消化bapad-PCR片段，并將其克隆到pETDuet-setal的相應位點以構建pETDuet-setal-bapad；

3)以pET21b-lpvpr為模板，用T7-N和vpr-C為引物對含有T7啟動子，核糖體結合位點(RBS)和vpr基因的片段進行PCR擴增；擴增的片段用限制性內切酶XhoI和PacI消化，并插入載體pETDuet-setal-bapad的相應位點中，得到重組質粒pETDuet-tal-pad-vpr。

6.根據權利要求4所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步驟(2)中，構建得到的重組菌為E.coli TransB-TPV。

7.根據權利要求4所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步驟(3)中，添加滲透劑，滲透劑為1M的山梨醇和2.5mM的甜菜堿。

8.根據權利要求4所述的利用甘油制備4-乙基苯酚的方法，其特征在于，步驟(3)中，在20℃誘導16h后轉入37℃中再培養72h。