[發(fā)明專利]一種土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測的引物和試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010198959.6
• 申請日: 2020-03-20
• 公開（公告）號: CN111235237A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 汪義龍
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇為青生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 周敏;汪青

本發(fā)明涉及一種用于土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測的引物和試劑盒，以及利用該引物對土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因進(jìn)行絕對定量檢測的方法。所述引物的正向引物序列與GCAGCCCGAGTACAACAAG具有至少85％的同源性，反向引物序列與TCCAGACCGAGAACCACAC具有至少85％的同源性。采用本發(fā)明的引物，擴(kuò)增效率高，并且可以擴(kuò)增更多硝化細(xì)菌的nirS基因。采用本發(fā)明的試劑盒對土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測，操作方便，速度快，精確度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及生物的分子檢測，更具體涉及一種土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測的引物和試劑盒。

背景技術(shù)

反硝化作用是反硝化細(xì)菌在無氧或者微氧環(huán)境下催化NO₃^-，最終生成N₂的過程。氧化亞氮還原酶基因(nirS)參與反硝化反應(yīng)過程中NO₃^-→NO₂^-→NO→N₂O→N₂中NO₂→NO的轉(zhuǎn)化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的反硝化細(xì)菌包括了蒼白桿菌屬(Ochrobacturum)、假單胞菌屬(Pseudomonaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonaceae)、無色桿菌屬(Achrombacter)、短桿菌屬(Brevibacterium)、蒼白桿菌屬(Ochrobacturum)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)等。由于反硝化細(xì)菌種類較多，可以使用16S rRNA高通量測序的方法研究反硝化細(xì)菌的多樣性，但是在研究細(xì)菌的拷貝數(shù)時，此方法存在通量低，速度慢，費用高等問題。亞硝酸鹽還原酶是反硝化作用的一個重要酶，存在兩種編碼亞硝酸鹽還原酶的基因，分別是nirK和nirS。可以通過定量PCR的方法檢測土壤中nirS基因的拷貝數(shù)，從而比較不同土壤在生物脫氨過程中的差異。目前用于nirS基因定量PCR檢測的引物(F：TCGCCSATYCCGGCSATGTC和R：GAGTTGTACCAGTCRGCSGAYTCSG)存在較多的兼并堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物長度在170bp左右，兼并堿基過多嚴(yán)重影響引物的擴(kuò)增效率。陳娜等(2019)使用正向引物序列為GTSAACGTSAAGGARACSGG，反向引物序列為GASTTCGGRTGSGTCTTGA的引物進(jìn)行土壤中nirS基因的實時定量PCR檢測；扈培龍(2015)使用的引物的正向引物序列為TACCACCCCGAGCCGCGCGT，反向引物序列為GCCGCCGTCRTGVAGGAA，但是上述這些定量PCR檢測引物或存在較多的簡并堿基，或擴(kuò)增長度較長，影響了擴(kuò)增效率，并不適合用于定量PCR檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種無簡并堿基且擴(kuò)增長度更短的，用于土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測的引物和試劑盒。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測的引物，所述的引物的正向引物序列與GCAGCCCGAGTACAACAAG(SEQ ID NO：1)具有至少85％的同源性，優(yōu)選具有至少90％的同源性，更優(yōu)選具有至少94％的同源性；反向引物序列與TCCAGACCGAGAACCACAC(SEQ ID NO：2)具有至少85％的同源性，優(yōu)選具有至少90％的同源性，更優(yōu)選具有至少94％的同源性。

優(yōu)選地，所述的引物的正向引物序列為GCAGCCCGAGTACAACAAG(SEQ ID NO：1)，反向引物序列為TCCAGACCGAGAACCACAC(SEQ ID NO：2)。

本發(fā)明還提供一種用于土壤中反硝化細(xì)菌nirS基因絕對定量檢測的試劑盒，所述的試劑盒包括任一項本發(fā)明中所述的引物。

優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括進(jìn)行定量PCR檢測時所需的試劑，具體實施時，操作更加方便、快速。