[發明專利]一種用于蛋白酶酶譜法的原位凝膠制備方法

有效

• 申請號: 202010197858.7
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111253594B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發明（設計）人: 錢進;劉寅;陸卞和;趙媛媛;錢心緣;沈俊煒;朱鑫澤
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C08J3/075
• 分類號: C08J3/075;C08L5/12;C08L5/16;C08L89/00;C12Q1/37
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 嚴海晨

本發明是一種用于蛋白酶酶譜法的原位凝膠制備方法，屬于土壤酶譜法技術領域。本發明的目的在于提供一種以瓊脂糖、明膠、β?環狀糊精和PBS（磷酸鹽緩沖溶液）為實驗原料制備的原位凝膠技術，可用于根際土壤中蛋白酶分布的測定，也可廣泛用于蛋白酶酶譜法實驗材料。這種用于蛋白酶酶譜法的原位凝膠制備技術填補了相關凝膠制備技術的缺失，通過制備高質量的原位凝膠對實驗土壤進行孵育，繪制成酶譜圖，為土壤中酶活性計算提供便利。

技術領域

本發明是一種用于蛋白酶酶譜法的原位凝膠制備方法，屬于土壤酶譜法技術領域。

背景技術

隨著土壤酶譜法的發展進步，相關學者對土壤中微生物活動空間分布的探索方式也更加新穎。由于酶譜法是一種不需要破壞土壤結構的原位方法，因此它能夠更真實地描繪酶活性。在以后的土壤微生物研究或根際效應的研究中，土壤酶譜法會得到更加廣泛的普及與運用。

根據已有研究，土壤酶活性的高低關乎土壤微生物活性，在反映微生物活性狀況等方面極具參考研究價值，而植物的根際土壤受根系分泌物堆積影響強烈，土壤微生物在此微域多有集聚現象，故土壤酶活性在根際微區普遍偏高。所以根際土壤的酶活性相對于一般土壤的酶活性更具研究價值。

在用于研究根際土壤蛋白酶分布的蛋白酶酶譜法中，采用覆蓋有相應底物分子的膜來測量土壤中蛋白酶的分布。這些膜可以在以凝膠為基質的土壤表面上孵育，并基于考馬斯亮藍、銀染法對蛋白質的染色原理對原位凝膠進行著色。最后利用比色法處理生成酶譜圖。

目前利用蛋白酶酶譜法來定位和定量土壤中的蛋白酶酶活性的嘗試中，尚未有一種明確的優質原位凝膠制備技術或相關參數。制作一種均質、穩定、硬度合適的便于蛋白酶孵育的凝膠是蛋白酶譜酶法的核心。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以瓊脂糖、明膠、β-環狀糊精、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）等為實驗原料制備的原位凝膠方法，可用于根際土壤中蛋白酶分布的測定，也可廣泛用于蛋白酶酶譜法實驗材料。這種用于蛋白酶酶譜法的原位凝膠制備技術填補了相關凝膠制備技術的缺失，通過制備高質量的原位凝膠對實驗土壤進行孵育，繪制成酶譜圖，為土壤中酶活性計算提供便利。

本發明的技術解決方案：一種用于蛋白酶酶譜法的原位凝膠制備方法，包括以下步驟：

（1）配液：凝膠采用瓊脂糖配制，加入明膠用于確定蛋白酶活性，加入β-環狀糊精增加所制備凝膠的穩定性，加入PBS作為保護劑；最后將以上原材料在去離子水中混合均勻；

（2）化膠：將所配置溶液置于高壓蒸氣滅菌鍋中，在0.5mpa的條件下加熱至70℃，加熱時間持續5-15min，至溶液呈澄清狀態取出；

（3）冷凝成型：準備玻璃室厚度為1mm的玻璃室，玻璃室需可拆卸供所制備凝膠的取用；將所制備的凝膠溫度控制在65-75℃，澆鑄在玻璃腔室內冷卻成型；

（4）孵育：凝膠冷卻成型后立即拆開玻璃室的一面，穩定住凝膠的一面將其覆蓋在平整干燥的根際土壤表面；用塑料薄膜覆蓋住凝膠防止其失水干燥，在黑暗條件中以室溫孵育24小時；

（5）染色：將孵育好的凝膠取下，放置在蒸餾水中，用水平搖床以80rmp處理2分鐘以除去表面的附著的土壤；配置水合茚三酮染色溶液并將處理好的凝膠放置在染色溶液中著色10分鐘；

（6）脫色：將著色后的凝膠置于脫色溶液中在水平搖床中以80rmp處理25-35分鐘取出。

所述的步驟（1）配液中，凝膠采用1.4 （w/v）%瓊脂糖配制，明膠含量為0.08w/v%，β-環狀糊精含量為0.2 （w/v）%，PBS濃度為0.2 （v/v）%。

所述的步驟（5）染色中所用染色溶液用0.5 （w/v）%水合茚三酮配置，并用乙酸將溶液的pH調節至5.9。

所述的步驟（6）脫色中所用的脫色溶液用10 （v/v）%乙醇和10 （v/v）%乙酸配制。