[發明專利]一種用于治療腦梗死的臍帶間充質干細胞注射液制備方法

在審

• 申請號: 202010196676.8
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111346051A
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 張海心
• 申請（專利權）人: 瑞太干細胞中心（沈陽）有限公司
• 主分類號: A61K9/08
• 分類號: A61K9/08;A61K35/28;A61P9/10;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于治療腦梗死的人臍帶間充質干細胞注射液的制備方法，其特征在于，所述培養方法包括以下步驟：人臍帶組織塊的獲取、人臍帶間充質干細胞的原代培養、人臍帶間充質干細胞的傳代培養、人臍帶間充質干細胞特征的檢測和人臍帶間充質干細胞制劑的制備。本發明作為一種用于治療腦梗死的臍帶間充質干細胞注射液制備方法的優選方案，其有益效果在于：避免了外源動物血清及人源血清或血清替代物的引入，降低了在制劑中引入外源微生物或致敏源的風險；提高了所得人臍帶間充質干細胞的存活率、增值能力和特異性。本發明所制備的人臍帶間充質干細胞注射液工藝簡便，質量控制嚴格，具有較好的臨床應用前景。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種用于治療腦梗死的臍帶間充質干細胞注射液制備方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells)是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，源于發育早期的中胚層，主要存在于結締組織和器官間質中，可以從骨髓、外周血、脂肪及皮膚等多種組織中獲得。間充質干細胞屬于非終末分化細胞，它既有間質細胞的特征，又有內皮細胞及上皮細胞的特征；作為一類多能干細胞，它在體外特定的誘導條件下，可以向骨、軟骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神經、內皮及胰島樣細胞等方向增殖分化。

間充質干細胞培養過程中會分泌干細胞因子(SCF)、表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板源性生長因子A(PDGF-A)、轉化生長因子(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)、白細胞介素(IL)、胰島素樣生長因子(IGF-Ⅱ)、巨噬細胞集落刺激因子(GSFs)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN)、神經生長因子(NGF)，以及其他還沒有被分離的分子物質。這種復合細胞因子在人體內能夠促進細胞增殖、分化、再生，加強新陳代謝，防止細胞衰老；介導機體細胞信號傳導，活化機體干細胞，促進新毛細血管形成，進行生理性修復；調節機體亞健康，提高機體免疫清除損傷、病變、衰老的細胞。有研究表明，使用干細胞分泌因子及外泌體與使用干細胞具有相同的作用，因此用干細胞聯合干細胞分泌因子做治療與單純用干細胞相比，優勢明顯。

目前國內關于治療腦梗死的臍帶間充質干細胞注射液制備方法很少見，而這個對于腦梗死的細胞治療的意義很大，所以也是寫本專利的動力所在。

發明內容

本發明提供一種用于治療腦梗死的臍帶間充質干細胞注射液制備方法，該方法操作過程簡單可靠，應用效果較好。

具體操作步驟如下：

(1)選取行剖宮產術的健康初產婦，經產婦及家屬同意，無菌采集整條臍帶；

(2)用PBS洗去臍帶殘存血液，縱向剖開臍帶，并剔除動靜脈血管；

(3)用組織剪將臍帶組織均勻剪碎成1mm³大小的組織塊；

(4)將所得組織塊接種在10cm培養皿中，放置于恒溫培養箱(二氧化碳濃度3％-8％，溫度36℃-39℃，濕度85％-100％)內1-3小時；

(5)待組織塊貼壁比較牢固后，輕輕加入適量的無血清培養基，放置于恒溫培養箱(二氧化碳濃度3％-8％，溫度36℃-39℃，濕度85％-100％)內靜置培養；

(6)24-48小時后換液，去除多余組織及細胞碎片；

(7)約5-7天左右，瓶中貼壁細胞鋪滿約60％-90％時，用0.25％胰蛋白酶消化，所得細胞即為原代臍帶間充質干細胞；

(8)將步驟(7)所得原代間充質干細胞懸液按1:2-1:4比例進行傳代接種培養，所得細胞記為第一代(P1)；

(9)待細胞生長鋪滿約60％-90％時，重復步驟(7)、(8)，繼續進行傳代擴大培養；