[發(fā)明專(zhuān)利]抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010196503.6
• 申請(qǐng)日: 2020-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111471655B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張洋
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖州正熙醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10;C12N15/13;C12N15/85;C12P21/02;C12R1/91
• 代理公司: 杭州豐禾專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王靜

本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述的細(xì)胞株被命名為抗人IL12/23?CHO?S穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，于2020年3月11日保藏在位于武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?No.C202050。本發(fā)明的抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株CHO?S的抗人IL12/23抗體產(chǎn)量可達(dá)到2.9g/L，是現(xiàn)有的抗人IL12/23抗體表達(dá)細(xì)胞株的6倍；不同生產(chǎn)批次之間抗體產(chǎn)量穩(wěn)定、抗體質(zhì)量高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和?應(yīng)用。

背景技術(shù)

IL12/23(白細(xì)胞介素12/白細(xì)胞介素23)是在炎癥和免疫應(yīng)答中自然出現(xiàn)的細(xì)胞因子，?被認(rèn)為在免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括斑塊型銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、克?羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。

抗人IL12/23單抗能夠通過(guò)與IL-12和IL-23所共有的p40亞單位相結(jié)合，阻止其與細(xì)胞?表面的受體IL-12β1相結(jié)合，來(lái)抑制這2種前炎性細(xì)胞因子，降低因IL12/23過(guò)量產(chǎn)生和釋?放引發(fā)的炎癥反應(yīng)，對(duì)于治療由IL12/23過(guò)量產(chǎn)生引發(fā)的疾病具有重要的臨床意義。抗人?IL12/23單抗(烏司奴單抗)是一種可自我注射的生物治療藥物，它在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總?局(CFDA)獲批了1個(gè)適應(yīng)癥，銀屑病的治療。

分泌單克隆抗體細(xì)胞株的傳統(tǒng)制備方法為免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合法，包括抗?原免疫、細(xì)胞融合、細(xì)胞株篩選、細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建等過(guò)程。由于小鼠抗體相對(duì)于人體為異種抗原，?因此當(dāng)小鼠單克隆抗體注入人體后會(huì)引發(fā)機(jī)體嚴(yán)重的排斥反應(yīng)。同時(shí)，傳統(tǒng)方法制備的融合?細(xì)胞株容易產(chǎn)生染色體丟失、基因缺失等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響單克隆抗體生產(chǎn)過(guò)程中不同批次之間的穩(wěn)定性，影響產(chǎn)品質(zhì)量。此外，融合細(xì)胞株還存在抗體產(chǎn)量低、細(xì)胞培養(yǎng)困難等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)的發(fā)明目的是提供一種具有較高的抗人IL12/23抗體產(chǎn)量的抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞?株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本申請(qǐng)的技術(shù)方案如下：

一種抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，所述的細(xì)胞株被命名為抗人IL12/23CHO-S穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，?于2020年3月11日保藏在位于武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?No.?C202050。

所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1)制備含有抗人IL12/23抗體重鏈基因的質(zhì)粒和含有抗人IL12/23抗體輕鏈基因的質(zhì)?粒，并將上述兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染親代CHO-S細(xì)胞；

(2)對(duì)轉(zhuǎn)染完成的CHO-S細(xì)胞進(jìn)行Puromycin/G418篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞；

具體地，所述的Puromycin/G418篩選包括：將轉(zhuǎn)染完成的細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，48?h后將完全培養(yǎng)液更換為含有10ug/mL?puromycin和800ug/mL?G418的篩選培養(yǎng)液，并每隔?3-4天更換一次篩選培養(yǎng)液，直至細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)；

作為優(yōu)選，所述的篩選培養(yǎng)液中puromycin和G418的終濃度分別為10ug/mL和800ug/mL。

作為優(yōu)選，所述的Puromycin/G418篩選還包括：將在篩選培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞接種?至完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得已成功轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。

作為優(yōu)選，將在篩選培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞接種至完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，接?種后，完全培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度為5×10⁵cells/mL。

(3)對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行單克隆細(xì)胞株分選，獲得所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株CHO-S。