[發(fā)明專利]抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株及其構建方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010196503.6
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111471655B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 張洋
• 申請（專利權）人: 湖州正熙醫(yī)學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/13;C12N15/85;C12P21/02;C12R1/91
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王靜

1.一種抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株，其特征在于，所述的細胞株被命名為抗人IL12/23CHO-S穩(wěn)轉細胞株，于2020年3月11日保藏在位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?No.?C202050。

2.一種抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備含有抗人IL12/23抗體重鏈基因的質粒和含有抗人IL12/23抗體輕鏈基因的質粒，并將上述兩種質粒共轉染親代CHO-S細胞；

（2）對轉染完成的CHO-S細胞進行Puromycin/G418篩選，獲得穩(wěn)轉細胞；

（3）對穩(wěn)轉細胞進行單克隆細胞株分選，獲得所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株CHO-S。

3.如權利要求2所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株的構建方法，其特征在于，步驟（2）中，所述的Puromycin/G418篩選包括：將轉染完成的細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，48?h后將完全培養(yǎng)液更換為含有10ug/mL?puromycin和800ug/mL?G418的篩選培養(yǎng)液，并每隔3-4天更換一次篩選培養(yǎng)液，直至細胞穩(wěn)定生長。

4.如權利要求3所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株的構建方法，其特征在于，所述的篩選培養(yǎng)液中puromycin和G418的終濃度分別為10ug/mL和800ug/mL。

5.如權利要求3所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株的構建方法，其特征在于，所述的Puromycin/G418篩選還包括：將在篩選培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的細胞接種至完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，獲得已成功轉染的穩(wěn)轉細胞。

6.如權利要求5所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株的構建方法，其特征在于，將在篩選培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的細胞接種至完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，接種后，完全培養(yǎng)液中的細胞密度為5×10⁵?cells/mL。

7.如權利要求2所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株的構建方法，其特征在于，步驟（3）中，所述的單克隆細胞株分選包括：將穩(wěn)轉細胞中的單克隆細胞株一一接種至完全培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)12-14天后檢測各單克隆細胞株的抗人IL12/23抗體產量，獲得所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株CHO-S。

8.如權利要求1中所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株在制備抗人IL12/23抗體中的應用。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

（a）將所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉細胞株CHO-S接種到含有完全CD培養(yǎng)液的搖瓶中，置于37℃，5%?CO₂的環(huán)境中，于120rpm下進行傳代培養(yǎng)；

（b）傳代培養(yǎng)完成后，將細胞轉移至較大體積培養(yǎng)搖瓶內，細胞接種后初始密度要大于3×10⁵?cells/mL；為了使培養(yǎng)液中有更高的溶氧量，培養(yǎng)搖瓶內培養(yǎng)液的體積不要超過培養(yǎng)瓶總體積的1/5；

（c）待細胞密度達到1×10⁶?cell/mL后，切斷二氧化碳供應，將搖床轉速調節(jié)至130-135rpm；

（d）繼續(xù)培養(yǎng)6-8天，收集培養(yǎng)液，離心并經0.45μm濾膜過濾，獲得細胞培養(yǎng)上清液，依次對細胞培養(yǎng)上清液進行純化和洗脫，獲得抗人IL12/23抗體。

10.如權利要求1中所述的抗人IL12/23穩(wěn)轉株細胞株在制備原料藥，原料試劑或原料化妝品中的應用。