[發(fā)明專利]一種基于RAA-CRISPR-cas13a檢測HBV cccDNA的試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010195047.3
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN113493855A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張向穎;任鋒;李浩;周育森;田原;金榮華;段鐘平;陳德喜;李偉華
• 申請（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發(fā)明公開了一種基于RAA?CRISPR?cas13a檢測HBV cccDNA的試劑盒。本發(fā)明提供了一種核酸分子組合物，由引物F1、引物R1和特異crRNA組成；引物F1為序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；引物R1為序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；特異crRNA為序列表的序列3所示的單鏈RNA分子。本發(fā)明將跨缺口引物、RAA擴(kuò)增和基于CRISPR?Cas13a系統(tǒng)的可視化檢測結(jié)合在一起用于HBV cccDNA檢測，擴(kuò)增速度快、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量高、成本低，能實(shí)現(xiàn)對乙肝的早期檢測和藥物療效的有效監(jiān)測，為乙肝的個體化治療奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于RAA-CRISPR-cas13a檢測HBVcccDNA的試劑盒。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起乙型肝炎(簡稱乙肝)的病原體，屬嗜肝DNA病毒科。在乙型肝炎病毒的復(fù)制過程中，病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核，在DNA聚合酶的作用下，兩條鏈的缺口均被補(bǔ)齊，形成超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子(covalentlyclosed circularDNA，cccDNA)。細(xì)胞外乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA(relaxed circularDNA，rcDNA)分子。cccDNA是乙型肝炎病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板，雖然其含量較少，每個肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個拷貝，但對乙型肝炎病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義，只有清除了細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)，是抗病毒治療的目標(biāo)。

全球HBV慢性感染者約為2.57億人，由HBV感染引起的失代償肝硬化、肝衰竭和肝癌導(dǎo)致約90萬人死亡，我國人群整體攜帶率為6.1％，約占全球的1/3。慢性乙型肝炎難以治愈的關(guān)鍵因素是未能徹底清除的HBV cccDNA，它是病毒復(fù)制產(chǎn)生的所有RNA和子代病毒合成的模板，可以在肝細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定地存在，且目前現(xiàn)有的抗病毒藥均不能清除cccDNA，故HBV cccDNA的存在被認(rèn)為是HBV感染慢性化及抗HBV治療停止后肝炎復(fù)發(fā)最主要原因，解析cccDNA的調(diào)控機(jī)制被國內(nèi)外專家公認(rèn)為是慢乙肝治愈策略中需要優(yōu)先解決的重要科學(xué)問題。因此，HBV cccDNA的檢測對深入研究HBV致病機(jī)制、評價乙肝患者藥物療效等方面具有重要意義。

HBV cccDNA在患者肝臟中的水平極低，每個肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個拷貝，對檢測技術(shù)的靈敏度提出了較高要求。rcDNA與ccc DNA序列的高度同源性，又需要檢測技術(shù)同時具有高度特異性。

目前HBV cccDNA常用檢測技術(shù)包括：①Southern印跡雜交：該方法定性檢測較為準(zhǔn)確，但操作繁瑣、敏感性較低且不能準(zhǔn)確定量，需標(biāo)本量也較大，故在臨床上應(yīng)用較少；②套式或選擇性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：檢測敏感性比較好，但是由于需要多次擴(kuò)增，并且對PCR產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽性；③實(shí)時熒光定量PCR法：該檢測方法的特異性比選擇性PCR進(jìn)一步提高，可以消除高rcDNA背景可能產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，靈敏度也明顯提高，但仍不能完全排除rcDNA非特異性擴(kuò)增存在；④微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)方法：ddPCR方法能夠檢測到血清、單細(xì)胞和FFPE腫瘤組織中的cccDNA，與Southern blot及其他方法相比，檢測cccDNA的靈敏性提高，但是價格昂貴，不利于廣泛推廣。