[發(fā)明專利]cfDNA末端修復(fù)的酶組合物、緩沖液試劑和測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010194914.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-19
• 公開（公告）號(hào): CN111378632B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余麗萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C12N9/22;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 北京惠智天成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11681
• 代理人: 王園園

本發(fā)明提供了cfDNA末端修復(fù)酶組合物，包括如下幾種酶：使cfDNA在dNTP存在下進(jìn)行DNA雙鏈修復(fù)及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ為Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo?；使cfDNA 5’端發(fā)生磷酸化修飾的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ?yàn)門4多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase，簡(jiǎn)稱T4 PNK）。本發(fā)明還提供了一種cfDNA末端修復(fù)緩沖液試劑。本發(fā)明還提供了使用上述的試劑進(jìn)行cfDNA末端修復(fù)和構(gòu)建cfDNA測(cè)序文庫(kù)的方法。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：本發(fā)明的試劑酶用量少，成本低，且具有意想不到的更高的修復(fù)效率，適用于樣本量較低的cfDNA進(jìn)行末端修復(fù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種cfDNA末端修復(fù)的酶組合物、緩沖液試劑和測(cè)序文庫(kù)的構(gòu) 建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

血漿游離DNA(circulating cell free DNA,cfDNA)是一種細(xì)胞外游離于體 液中的DNA，cfDNA片段大小在150-400bp之間。cfDNA測(cè)序廣泛應(yīng)用于腫瘤 疾病的診斷，產(chǎn)前篩查。鑒于血液中cfDNA含量較少，而且片段較短，限制了 高通量測(cè)序的測(cè)序深度。

因此，有必要通過提高cfDNA的末端修復(fù)及加A效率，保證建庫(kù)效率，高 通量測(cè)序數(shù)據(jù)能夠覆蓋到所有cfDNA，提高測(cè)序數(shù)據(jù)的真實(shí)性及可靠性。

中國(guó)專利CN201480062608.5提供了一種用于DNA末端修復(fù)、腺苷酸化、 磷酸化的酶組合物，所述組合物包含缺乏5'-3'和3'-5'外切核酸酶活性的經(jīng)修飾 的Taq DNA聚合酶，其與T4 DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶和 所有其它必要的組分包括反應(yīng)緩沖液和三磷酸核苷預(yù)混，其為在一個(gè)管內(nèi)并經(jīng)兩 個(gè)步驟進(jìn)行DNA鈍化、磷酸化和單核苷酸延伸反應(yīng)所需。

中國(guó)專利CN201610040334.0公開了一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加 dA的方法及應(yīng)用，具體涉及一種采用一步法進(jìn)行DNA末端修復(fù)/加dA的方法 及其應(yīng)用，所述方法采用T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶 的混合酶系。

國(guó)際申請(qǐng)PCT/CN2016/106609(國(guó)際公布號(hào)：WO 2018/090373 A1)公開 了一種DNA末端修復(fù)與加A的方法，該方法包括：在同一反應(yīng)體系中，在dNT P存在下，利用聚合酶將片段化DNA的末端補(bǔ)平或切平，利用多聚核苷酸激酶 將5’羥基轉(zhuǎn)變成5’磷酸基團(tuán)且將3’磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)變成3’羥基；在過量dATP存在下， 利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在雙鏈DNA3’末端加上dATP。

上述專利都存在著一些不足，如酶用量較多，成本較高，或者不適用于樣本 量較低的cfDNA進(jìn)行末端修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題：提供一種新的 cfDNA末端修復(fù)的酶組合物以及緩沖液試劑，來提高cfDNA末端平齊化及雙鏈 DNA 3’端加A效率。

本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下：

現(xiàn)有技術(shù)中DNA片段的末端修復(fù)可以使用klenow fragment、T4 DNA Polymerase、Taq DNA polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment， Exo-。其中KlenowFragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5' 外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。T4 DNA Polymerase 具有3'→5'外切酶活性，但不具有5'→3'外切酶活性，用于末端平齊化。由于 Klenow Fragment，Exo-沒有外切酶活性，其在末端補(bǔ)平時(shí)經(jīng)常會(huì)在3'末端額外加 上1個(gè)或多個(gè)核苷酸，用于加A。Taq DNA polymerase具有5'→3'聚合酶活性， 形成3’端帶A的產(chǎn)物。cfDNA完整性較物理打斷的基因組DNA高，末端修復(fù) 酶混合液可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行縮減。