[發明專利]cfDNA末端修復的酶組合物、緩沖液試劑和測序文庫的構建方法

有效

• 申請號: 202010194914.1
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111378632B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 余麗萍
• 申請（專利權）人: 江蘇康為世紀生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N9/22;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 北京惠智天成知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11681
• 代理人: 王園園

1.含有cfDNA末端修復酶組合物和cfDNA末端修復緩沖液試劑的cfDNA末端修復試劑，其特征在于，

所述的cfDNA末端修復酶組合物，由如下幾種酶組成：

使cfDNA在dNTP存在下進行DNA雙鏈修復及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ為Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo-；

使cfDNA 5’端發生磷酸化修飾的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ為T4多聚核苷酸激酶（T4Polynucleotide Kinase，簡稱T4 PNK）；

每50μL 反應體系中含有：T4多聚核苷酸激酶 2.5U；Klenow Fragment，Exo- 1U；TaqDNA聚合酶 3U；

所述的cfDNA末端修復緩沖液試劑，在末端修復時，每50ul反應體系中加入5ul的10×末端修復緩沖液，所述的10×末端修復緩沖液試劑的組分和含量如下：

所述的Tris-Hcl的pH為8.3。

2.含有如權利要求1所述的cfDNA末端修復試劑的cfDNA末端修復試劑盒。

3.含有如權利要求1所述的cfDNA末端修復試劑的cfDNA建庫試劑盒。

4.使用如權利要求1所述的cfDNA末端修復試劑進行cfDNA末端修復的方法，其特征在于，具體方法如下：在末端修復緩沖液試劑中用末端修復酶組合物處理cfDNA以產生末端平齊化且3'端加A的cfDNA；

所述的末端修復反應體系的pH值為8.0～8.3；

所述的反應條件為先在35～40℃反應10～15min；然后在60～70℃反應10～15min。

5.使用如權利要求1所述的cfDNA末端修復試劑進行cfDNA測序文庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）在末端修復緩沖液試劑中用末端修復酶組合物處理cfDNA以產生5’端磷酸化且3’端加A的cfDNA；

2）末端修復產物接頭連接反應，在末端修復體系中直接加入MGI接頭、T4連接酶及T4連接Buffer，進行接頭連接；

3）接頭連接產物進行磁珠純化，去除反應體系中的酶、鹽離子及殘余接頭；

4）使用高保真DNA聚合酶，對連接產物進行富集，反應結束后磁珠純化；

所述的步驟1）中，

末端修復反應體系的pH值為8.0-8.3；

反應條件為先在35～40℃反應10～15min；然后在60～70℃反應10～15min。