[發明專利]用于檢測黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP試劑盒及其專用引物和應用

有效

• 申請號: 202010194593.5
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111424116B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 袁靜;蔣棟;劉翟;陳晨;閆超;薛冠華;馬莉萍;曾輝
• 申請（專利權）人: 首都兒科研究所;中國科學院武漢病毒研究所;首都醫科大學附屬北京地壇醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發明公開了一種用于檢測黃熱病毒疫苗株的RT?LAMP試劑盒及其專用引物和應用，屬于生物技術檢測領域。提供的用于檢測黃熱病毒疫苗株的RT?LAMP引物能夠實現對黃熱病毒疫苗株的特異性檢測和鑒別，提供的RT?LAMP試劑盒的檢測操作簡單、特異性強、靈敏度高，可以快速且高效對黃熱病毒疫苗株進行檢測和鑒別，可以用于畜牧業生產單位、基層醫療衛生單位和各疾病預防控制中心篩查和鑒別黃熱病毒疫苗株。

技術領域

本發明屬于生物技術領域中病毒的分子生物學檢測方法，具體涉及一種用于檢測黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP檢測專用引物和檢測試劑盒。

背景技術

黃熱病毒(Yellow?fever?virus)是黃病毒科(Flaviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)的單股正鏈RNA病毒。病毒經蚊蟲傳播，傳播媒介主要為埃及伊蚊，臨床特征有發熱、劇烈頭痛、黃疸、出血和蛋白尿等，目前主要在非洲及南美洲流行。人群對黃熱病毒疫苗株較為易感，病死率可達20％-40％，是國際三大檢疫傳染病之一，目前通過接種黃熱病毒減毒活疫苗來控制黃熱病的流行。目前使用的疫苗株為Theiler和Smith在1936年減毒的Asibi株，命名為17D株，并在17D株的基礎上進一步傳代減毒，衍生出現代生產黃熱疫苗所使用的17D-204(歐美國家使用)，17D-213和17DD疫苗株(巴西使用)。黃熱減毒疫苗已為世界大面積人群提供了近50年的保護力，是疫苗史上最安全有效的減毒活疫苗之一。

雖然目前我國未見有黃熱病的大規模流行，但我國某些地區的地理條件和氣候條件與黃熱病高發區域相似，也存在發病的可能性。在過去的20多年里，黃熱病感染者逐年增加，據世界衛生組織(WHO)估計，每年至少有20萬黃熱病病例，造成3萬人死亡，嚴重威脅到人們的健康。目前，黃熱病毒減毒疫苗已在世界范圍內大量使用，因此在檢疫口岸，需要結合黃熱病毒的檢測以及黃熱病毒疫苗株的鑒定，以快速判斷該病毒是否為輸入性感染病例或是否為新感染病例，及時對感染病例采取相應的處置措施，可將外來感染阻擋于國門之外。

因此需要建立黃熱病毒疫苗株的快速、靈敏檢測鑒別方法，以快速區分是否為輸入性感染病例或新感染病例，能夠盡早對疑似病例做出正確的實驗室診斷，對有效指導后續的疫情處理與防控工作具有極其重要的意義。

目前病毒疫苗株的鑒別檢測方法主要為利用PT-PCR及Real-time?RT-PCR的核酸檢測方法，該方法需要特殊儀器，一些設備條件相對簡陋的基層單位或檢疫口岸無法進行。

發明內容

針對現有技術中存在的問題的一個或多個，本發明的一個方面提供一種用于檢測黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP引物組，包括序列表中SEQ?ID?NO:2所示的引物F3、SEQ?ID?NO:3所示的引物B3、SEQ?ID?NO:4所示的引物FIP、SEQ?ID?NO:5所示的引物BIP、SEQ?ID?NO:6所示的引物LF和SEQ?ID?NO:7所示的引物LB。

本發明另一方面提供一種用于檢測黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP試劑盒，包含上述的RT-LAMP引物組。

上述RT-LAMP引物組在25μL反應體系中的使用濃度為：引物F3和B3的終濃度獨立地為2～8pmol，引物FIP和BIP的終濃度獨立地為24～36pmol，引物LF和LB的終濃度獨立地為10～16pmol。

上述引物F3和B3的終濃度獨立地為4pmol，引物FIP和BIP的終濃度獨立地為32pmol，引物LF和LB的終濃度獨立地為12pmol。

上述RT-LAMP試劑盒中還包含基礎反應試劑，所述基礎反應試劑包括：10×Thermopol?Reaction?Buffer、100mM?MgSO₄、5mM?betaine、10mM?dNTP、8U?Bst?DNApolymerase和7.5U?WarmStart?RTx?reverse?transcriptase。