[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP試劑盒及其專(zhuān)用引物和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010194593.5
• 申請(qǐng)日: 2020-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111424116B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁靜;蔣棟;劉翟;陳晨;閆超;薛冠華;馬莉萍;曾輝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 首都兒科研究所;中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

1.一種用于檢測(cè)黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，包含用于檢測(cè)黃熱病毒疫苗株的RT-LAMP引物組，其為序列表中SEQ?ID?NO:2所示的引物F3、SEQ?ID?NO:3所示的引物B3、SEQ?ID?NO:4所示的引物FIP、SEQ?ID?NO:5所示的引物BIP、SEQ?ID?NO:6所示的引物L(fēng)F和SEQ?ID?NO:7所示的引物L(fēng)B；

所述RT-LAMP引物組在25μL反應(yīng)體系中的使用濃度為：引物F3和B3的終濃度獨(dú)立地為2～8pmol，引物FIP和BIP的終濃度獨(dú)立地為24～36pmol，引物L(fēng)F和LB的終濃度獨(dú)立地為10～16pmol；

所述RT-LAMP試劑盒中還包含基礎(chǔ)反應(yīng)試劑，所述基礎(chǔ)反應(yīng)試劑包括：10×ThermopolReaction?Buffer、100mM?MgSO₄、5mM?betaine、10mM?dNTP、8U?Bst?DNA?polymerase和7.5UWarmStart?RTx?reverse?transcriptase；所述基礎(chǔ)反應(yīng)試劑在25μL反應(yīng)體系中的使用量分別為：10×Thermopol?Reaction?Buffer?2.5μl、100mM?MgSO₄?1.5μl、5mM?betaine4μl、10mM?dNTP3.5μl，Bst?DNA?polymerase?1μl，WarmStart?RTx?reverse?transcriptase0.5μl；

所述反應(yīng)體系在進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)時(shí)，控制反應(yīng)溫度為63℃-65℃。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述引物F3和B3的終濃度獨(dú)立地為4pmol，引物FIP和BIP的終濃度獨(dú)立地為32pmol，引物L(fēng)F和LB的終濃度獨(dú)立地為12pmol。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的RT-LAMP試劑盒，其特征在于，所述RT-LAMP試劑盒還包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照包含黃熱病毒疫苗株基因組RNA，所述陰性對(duì)照為不含黃熱病毒疫苗株基因組RNA的反應(yīng)體系。

4.一種采用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的RT-LAMP試劑盒檢測(cè)黃熱病毒疫苗株的非疾病診斷目的方法，包括以下步驟：

S1：提取待測(cè)樣品RNA；

S2：反應(yīng)體系配制：25μL反應(yīng)體系包含2μL待測(cè)樣品RNA、10×Thermopol?ReactionBuffer2.5μl、100mM?MgSO₄?1.5μl、5mM?betaine?4μl、10mM?dNTP?3.5μl，8U?Bst?DNApolymerase?1μl，7.5U?WarmStart?RTx?reverse?transcriptase?0.5μl，引物加入量為：100μM?FIP/BIP引物各0.8μl，100μM?LF/LB引物各0.3μl，100μM?F3/B3所示引物各0.1μl，ddH₂O補(bǔ)至25μl；

S3：將反應(yīng)體系置63℃-65℃條件下恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)45-60min，獲得反應(yīng)液；

S4：結(jié)果分析：使用鈣黃綠素顏色指示劑或濁度儀對(duì)所述反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)分析。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S3中將反應(yīng)體系置65℃條件下恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)50min。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，步驟S4中所述結(jié)果分析的具體方法為：當(dāng)使用鈣黃綠素顏色指示劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在反應(yīng)液中添加1μl的鈣黃綠素顏色指示劑，呈現(xiàn)綠色表示待測(cè)樣品中存在黃熱病毒疫苗株，為陽(yáng)性，呈現(xiàn)橙色表示待測(cè)樣品中不存在黃熱病毒疫苗株，為陰性；

當(dāng)使用濁度儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，濁度上升(0.1)表示待測(cè)樣品中存在黃熱病毒疫苗株，為陽(yáng)性，濁度無(wú)變化表示待測(cè)樣品中不存在黃熱病毒疫苗株，為陰性。