[發明專利]一種用于檢測金葡菌腸毒素sea、seb、sec基因的三重熒光定量PCR試劑盒

在審

• 申請號: 202010193860.7
• 申請日: 2020-03-19
• 公開（公告）號: CN111378727A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 孫冰清;姜芹;張文剛;顧欣;黃士新;商軍;吳劍平;張浩然;黃家鶯;張妤
• 申請（專利權）人: 上海市動物疫病預防控制中心(上海市獸藥飼料檢測所;上海市畜牧技術推廣中心)
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海驍象知識產權代理有限公司 31315
• 代理人: 林煒

1.一種用于檢測腸毒素基因sea、seb、sec的熒光定量PCR試劑盒，包括引物和探針，其特征在于：所述的引物、探針序列如下所示：

第一上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，

第一下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，

第一探針的序列如SEQ ID No.3所示，

第二上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，

第二下游引物的序列如SEQ ID No.5所示，

第二探針的序列如SEQ ID No.6所示，

第三上游引物的序列如SEQ ID No.7所示，

第三下游引物的序列如SEQ ID No.8所示，

第三探針的序列如SEQ ID No.9所示，

任意一個所述的探針的5’端標記有報告熒光基團，所述的探針的3’端標記有淬滅熒光基團。

2.根據就權利要求1所述的一種用于檢測腸毒素基因sea、seb、sec的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：還包括Premix ExTaq、陽性質粒及滅菌水。

3.采用權利要求1或2所述的試劑盒檢測腸毒素基因sea、seb、sec的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)先配制qPCR反應液，在每一個qPCR反應體系中，所述的qPCR反應液的體積為22μL，所述的qPCR反應液包括12.5μL 2×濃度的Premix ExTaq、1μL的第一上游引物、1μL第一下游引物、0.5μL第一探針、1μL第二上游引物、1μL第二下游引物、0.5μL第二探針、1μL第三上游引物、1μL第三下游引物、0.5μL第三探針、2μL滅菌雙蒸水，任意一個引物和探針的濃度均為10μM；

2)按照檢測樣品數n，n＝待檢樣品數+2，取qPCR反應液于離心管中，置渦旋振蕩器上振蕩，每管分裝22μL，蓋上管蓋備用；

3)將陰性對照液加入一個分裝管中，取各樣本的DNA3μL加入對應反應管中；最后取出陽性對照加入另一反應管中，各反應管標記后離心，取出置熒光定量PCR儀中；

4)qPCR反應條件：42℃5min，95℃預變性10s，按以下參數循環40次：95℃2min，95℃15s，55℃20s；55℃時熒光檢測，檢測通道：FAM，VIC，Cy5；

5)結果判定：若Ct值＞35或無數值的標本為陰性；FAM、VIC、Cy5通道Ct值≤30的標本為陽性標本；30＜Ct值＜35的樣本建議重做，重做結果Ct值為none為陰性，否則為陽性。

4.根據權利要求2所述的檢測腸毒素基因sea、seb、sec的方法，其特征在于：

檢測方法的質控標準如下：

(1)陰性對照的Ct值應等于none；

(2)陽性對照的Ct值應≤30，否則，此實驗視為無效；

(3)應該同時滿足上述2項條件，否則試驗無效。